第二章DNA的复制

DNA的复制DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

RNA病毒的遗传信息贮存在RNA分子，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了中心法则的内容。

中心法则

Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律1954年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”一.DNA复制概况DNA在复制时，以亲代DNA的每一条单链DNA作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一条亲代DNA.这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。

DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。2、实验证据（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl复制叉与复制子DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子(replicon)。一个复制子只含一个复制起点。复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，复制起点呈叉子形式，被称为复制叉(Replicationfork)。复制叉（Replicationfork）：DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉.复制叉复制叉部分生物复制子的比较从复制原点到终点，组成一个能够独立进行复制的DNA复制单位叫复制子复制子（replicon）：原核生物只有一个复制原点，整个染色体只有一个复制单位。真核生物有多个复制起始点，因此是多复制子。每个复制子在每一次细胞循环中只启动一次。DNA复制是从DNA分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点（复制起始点）（大肠杆菌用ori表示，酵母ARS）。是由一些具有特定核苷酸排列顺序的片段组成。富含A-T。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

复制起点DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。双向复制真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的；原核生物DNA的复制双向复制(BidirectionalReplication)无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。DNASynthesis由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，为了解释DNA的等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等提出了DNA的半不连续复制模型（semi-discontinuousreplication）。半不连续复制Semi-discontinuousreplication冈崎片段 前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制。

[3H]Thymidinepulse-chaselabelingandalkalinesucrosegradient:discoveryofsemi-discontinousreplication用3H脱氧胸苷短时间标记后提取DNA，得到不少平均长度为2-3kbDNA片段。用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量小片段累积，说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再生成大分子DNA。由于DNA聚合酶只能以5‘→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。DNA的半不连续复制以3′→5′方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5′→3′，这一条链被称为前导链(leadingstrand)。以5′→3′方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5′→3′，这条链被称为滞后链(laggingstrand)。由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

二.参与DNA复制的酶双螺旋DNA复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。DNA聚合酶只能延长已有的DNA或RNA引物链，不能从头起始DNA链的合成；在复制叉结构区内，DNA双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺旋DNA解旋并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成，DNA聚合酶不能完成这一过程;在不连续合成中形成短的冈崎片段的连接也是DNA聚合酶无法完成的。①DNA旋转酶(拓扑异构酶）；②使DNA双股链在复制叉解开的解旋酶；③在DNA复制前防止解开的DNA单链局部退火的DNA结合蛋白；④合成RNA引物的酶；⑤除去RNA引物的酶；⑥使冈崎片段共价连接的DNA连接酶1、DNA聚合酶

DNA聚合酶种类和生理功能：在原核生物中，已发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA聚合酶Ⅳ（polⅣ），DNA聚合酶Ⅴ（polⅤ）。前三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。

参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，通常为1－10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

RNA引物polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有5'→3‘DNA聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

Containstwocatalyticsites,oneforadditionofdNTPsandoneforremovalofthemispaired

dNTP.Thepolymerizationsite:(1)bindstotwometalionsthatalterthechemicalenvironmentaroundthecatalyticsiteandleadtothecatalysis.(2)Monitorstheaccuracyofbase-pairingforthemostrecentlyaddednucleotidesbyformingextensivehydrogenbondcontactswithminorgrooveofthenewlysynthesizedDNA.Exonuclease

site/proofreadingsiteDNAPolymerase-palmdomainBindstotheincoming

dNTP,enclosesthecorrectpaireddNTPtothepositionforcatalysisBendsthetemplatetoexposetheonlynucleotideatthetemplatethatreadyforformingbasepairwiththeincomingnucleotideStabilizationofthepyrophosphateDNAPolymerase-fingerdomainNotdirectlyinvolvedincatalysisInteractswiththesynthesizedDNAtomaintaincorrectpositionoftheprimerandtheactivesite,andtomaintainastrongassociationbetweenDNAPolanditssubstrate.DNAPolymerase-thumbdomainpolⅢ由十种亚基组成，其中α亚基具有5′→3′DNA聚合酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3′→5′外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorpronerepair)。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。

原核生物中的三种DNA聚合酶

在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。参与染色体DNA复制的是polα（延长滞后链）和polδ（延长前导链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

DNA复制的保真性： 为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1．遵守严格的碱基配对规律；2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

2、DNA解旋酶和单链结合蛋白 复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解旋酶（DNAhelicase）和单链DNA结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）。

DNA解旋酶是很多细胞过程所要求的（如核苷酸切除修复、同源重组、转录终止）。DNA解旋酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解链酶）。解链酶的作用示意图单链DNA结合蛋白行使很多涉及单链区域稳定性的功能。SSB与DNA单链相结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。SSB与DNA结合时有协同作用，当一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白聚合体。单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）的作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

3、拓扑异构酶天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA旋转酶去除解螺旋酶的解链产生的扭曲张力。大肠杆菌中的DNA旋转酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase），超螺旋：DNA双螺旋链再盘绕即形成的空间结构（1）正超螺旋(positivesupercoil)：

盘绕方向与DNA双螺旋方同相同

（2）负超螺旋(negativesupercoil)：

盘绕方向与DNA双螺旋方向相反

正超螺旋：两股以右旋方向缠绕的螺旋，在外力往紧缠的方向捻转时，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外力捻转造成的胁变。这样形成的螺旋为正超螺旋。负超螺旋：两股以右旋方向缠绕的螺旋在外力向松缠的方向捻转时，产生一个右旋的超螺旋以解除外力捻转造成的胁迫。这样形成的超螺旋为负超螺旋.正超螺旋负超螺旋天然DNA分子一般为负超螺旋负超螺旋DNA更易于局部解链，易于参加DNA的复制、转录等拓扑异构酶or溴化乙锭拓扑异构酶or溴化乙锭DNA扭曲与双螺旋相同（拧紧）DNA扭曲与双螺旋相反（松开）负超螺旋松弛DNA正超螺旋3、拓扑异构体（Topologicalisomer）：具有不同连接数的相同DNA分子4、拓扑异构酶（Topoisomerase）：能够改变DNA连接数从而改变DNA分子超螺旋水平的酶（1）拓扑异构酶I（topoisomerase--I）作用机制：切开环状一条链，连接数改变±1，不需ATP

（2）拓扑异构酶Ⅱ作用机制：切开环状两条链，连接数改变±2，需要ATP

结合到一条链上形成复合物切断一条链形成酶和蛋白的复合体共价连接Tyrosine-5’P一条链穿越重新连接L=2L=3

拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseI)拓扑异构酶Ⅱ－TopII引入负超螺旋作用于双链：涉及双链的断裂和连接－－每次使DNA的连接数改变2DNA拓扑异构酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA旋转酶的催化功能。当加入DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA旋转酶是DNA复制所必不可少的。4、引发酶与引物RNA的合成 DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3‘端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为1～10个核苷酸。催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺序，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3'-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。引物与典型的RNA（如mRNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。RNA引物必须去除以完成DNA复制！RNaseHDNApolymeraseDNAligase5、DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。三、DNA复制过程复制的起始(initiation)DNA链的延伸(elongation)复制的终止(termination)1.DNA复制的起始复制起始原点DNA双螺旋的解旋复制的引发 DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链，那么，新DNA的复制是怎样开始的呢？大肠杆菌(E.coli)的OriC复制原点参与DNA复制起始和引发的蛋白质DNA解旋酶(DNAhelicase)

催化DNA双链的解链过程。单链DNA结合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein)：

以四聚体形式存在于复制叉处，只保持单链的存在，并不能起解链作用。DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

消除DNA双链的超螺旋堆积。引物酶(primase)

合成一小段RNA引物，为DNA新链的合成提供3’-OH末端。2.DNA链的延伸DNA链的延伸需要的蛋白质:DNA聚合酶滑动夹（SlidingDNAclamp）RNA酶(RNaseH等) 在复制完成后切除RNA引物。DNA连接酶(DNAligase) 通过生成3’5’-磷酸二酯键连接两条DNA链。DNApolymerasecatalyzeDNAsynthesisDNAStructureofaslidingDNAclampSlidingDNAclampsencirclethenewlyreplicatedDNAproducedbyanassociatedDNApolymerase.SlidingclampsdramaticallyincreaseDNApolymeraseprocessivity(持续合成能力)RemovalofRNAprimersfromnewlysynthesizedDNARNA引物的切除3.

复制的终止当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。四.DNA复制的几种主要方式DNA复制通常是从双螺旋的特定位置——复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段，该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequentlyopeningregion），由此产生的瞬时单链与SSB蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。根据DNA合成的起始方式，复制可分为重新起始与共价延伸两种类型：前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制。复制主要以双向等速进行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的复制；部分是单方向进行，如质粒ColE1的复制；或以不对称的双向方式进行，如线粒体DNA的复制。1、复制叉式复制

(一)、复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。

1、预引发：（1）．解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白结合在两条单链DNA上，形成复制叉。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。对于双向复制而言，形成的两个复制叉向相反方向行进，每个复制叉上的两条DNA链均被拷贝。（2）．引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。2、引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

（二）、复制的延长

1、聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以3′→5′方向的亲代DNA链为模板，从5′→3′方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长滞后链)和DNA聚合酶δ（延长前导链）。

2、引发体移动： 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

（三）、复制的终止

去除引物，填补缺口： 在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。 在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme2、滚环式复制θ型复制是双链环状DNA以复制叉方式进行复制的特例。某些双链环状DNA或单链DNA的复制型（replicationform,RF），在复制时，以滚环复制方式进行。滚环复制是在一条断裂的亲本链的3'-OH端不断地发生DNA聚合作用，因而又称共价延伸。由于断开的3'-OH端仍然与其互补链形成双螺旋结构，因而没有合成RNA引物的必要。合成先导链的模板也总是呈环状。滚环复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNA复制的共同方式，E.coli噬菌体（如φX174、M13）的环形双螺旋DNA复制时，仅仅以1条链作为模板合成若干环形DNA分子拷贝；某些双链DNA的合成也可以通过滚动环的复制方式进行，例如，噬菌体λ复制的后期以及真核生物如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA基因的扩增都是以这种方式进行的。Rollingcirclesproducemultimersofareplicon线粒体DNA的D-噜噗复制双链环状DNA中的一条前导链已经引发并开始合成，与其模板形成双链结构，而另一条亲本链则被前导链置换出来成为单链状态。这种由一条单链和一条双链组成的三元泡状结构，叫做置换噜噗或D-噜噗（displacementloop）。只有前导链将另一条亲本链（即滞后链的模板）的特别序列置换出来成为单链形式，才能产生滞后链前体的引发并合成其互补链。DNA复制的不同方式

3、真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

端粒结构Telomeres端粒是线状染色体末端的DNA重复序列。端粒是线状染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。把端粒当作一件绒线衫袖口脱落的线段，绒线衫像是结构严密的DNA，排在线上的DNA决定人体性状。与人头发的直与曲，眼睛的蓝与黑，人的高与矮等等，甚至性格的暴躁和温和有关。原核生物