SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳课件

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）实验目的了解电泳实验原理掌握电泳实验操作规程用电泳方法测定蛋白分子量实验目的电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳基本原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力F=XQ阻力F=6πγηυ当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动:F=FQX=6πηγνν/X=Q/6πηγ带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力F=XQ阻力F=影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压缓冲液：成分，pH，离子强度支持介质：电渗作用，吸附作用温度影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状分类连续电泳不连续电泳非变性电泳变性电泳分类连续电泳1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。分类1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。（2）凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。浓缩效应（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳课件成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.浓缩效应电荷效应分子筛效应不连续电泳三大效应：浓缩效应不连续电泳三大效应：非变性电泳变性电泳测定亚基分子量非变性电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDSDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含

当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：LgMW=－b

mR+K

其中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3～5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

垂直板电泳装置加样样品迁移方向垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶

按分子大小分离电泳方向

电泳

小分子大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。

相对迁移率标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶

等电聚焦电泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）

加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度

加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布等电聚焦电泳（IFE）凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-

双向电泳第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS

双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳第二向电泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3双向电泳第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）的聚合反应：单体：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰胺凝胶（polyacryl操作过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小烧杯

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好操作过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)ddH2O4.05ml6.8ml30%Acr3.3ml1.7mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.25ml10%SDS100µl100µl10%Ap50µl100µlTEMED10µl10µl

配胶分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)dd3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝

*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡

*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝

*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平

5.拔出样梳后,在槽中加入缓冲液

*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡

*胶凝6.上样：（1）marker5µl

（2）样品10µl+2×上样buffer10µl共20µl

100℃沸水浴，3-5min？（蛋白变性）

7.微量注射器（加样器）上样,上样量15µl

*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔6.上样：8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰

*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分

11.实验结果分析