补骨脂多成分药代动力学研究方法的建立及应用

补骨脂多成分药代动力学研究方法的建立及应用

补骨脂又名破岁纸（药理学）、胡韭菜子（南方记）、胡家乡子（中药志）等。中药药代动力学在中药现代化研究链条上发挥着“桥梁学科”的作用，在中药体内多组分物质基础、多靶点作用的药效和安全性等关键科学问题研究中均起着重要作用材料表面化合物结构鉴定补骨脂药材购于北京同仁堂药店。对照品补骨脂素(批号16051324)和异补骨脂素(批号16051721)购自上海同田生物技术股份有限公司；补骨脂苷(批号B-006-170426)和异补骨脂苷(批号Y-008-170408)购自成都克洛玛生物科技有限公司；内标滨蒿内酯(批号120-08-1)购自成都克洛玛生物科技有限公司。以上化合物的纯度均大于98%。质谱纯乙腈购自霍尼韦尔公司；质谱纯甲酸购自ROEScientificInc.(Newark,USA);超纯水为Milli-Q纯化系统自制(美国Millipore公司);分析物和内标的结构见图1。仪器液相-质谱联用分析系统(LC-MS/MS)由美国Waters公司生产的Acquity质谱检测条件化合物色谱分离采用WatersHSS-T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm);流动相均含0.004%甲酸的水和乙腈混合体系，其中A相为水-乙腈(99∶1),B相为水-乙腈(1∶99),梯度洗脱(0～2.5min,10%～20%B;2.5～2.6min,20%～40%B;2.6～6.0min,40%～65%B;6.0～7.0min,100%B;7.0～8.5min,10%B);柱温40℃,流速0.3mL·min质谱检测选用电喷雾离子源(ESI),源参数为：喷雾电压5500V;辅助气1(GS1)50psi(1psi≈6.895kPa);辅助气2(GS2)50psi;辅助气加热温度(TEM)500℃;气帘气(CUR)35psi;碰撞气(CAD)Medium。采用正离子多反应监测(MRM)模式，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷、异补骨脂苷和内标滨蒿内酯的检测离子对分别为187.2→131.1、187.1→131.2、384.2→205.1、384.1→205.2、207.0→151.1,解簇电压分别为115、115、50、50、60V,碰撞能量分别为35、35、15、15、33eV。鉴定scxk京科技战略规划Sprague-Dawley大鼠，体质量180～220g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。实验动物饲养于中国中医科学院中药研究所动物房，使用许可证号SYXK(京)2019-0003,饲养条件为室温(22±2)℃,相对湿度40%～70%,12h光照黑暗循环，正常饮食饮水，在此环境下适用1周，给药前禁食12h以上。方法和结果样品的制备和质量控制分别精密称定补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷、异补骨脂苷和内标滨蒿内酯，用乙腈溶解至1mg·mL残余渣的制备称取补骨脂100g,加入10倍纯水浸泡30min,煮沸2h,纱布滤过，剩余残渣再加8倍量水煎煮1h,滤过，合并2次滤液，混匀，减压浓缩至每1mL含生药2g,-20℃冰箱保存，备用。补骨脂提取液中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷和异补骨脂苷的质量分数分别为391、288、22800、12000μg·g样品前处理取体积为50μL的-70℃冻存的大鼠血浆样品，室温下放置，使其自然解冻后，加入10μL滨蒿内酯(15ng·mL方法学的检验特异性取大鼠空白血浆、加入化合物对照溶液的血浆、给药补骨脂提取物后15min的大鼠血浆，按线性关系和定量限取空白大鼠血浆45μL,加入不同浓度的5μL工作液后，2000r·min准确度和精度用低、中、高浓度质控样品进行批内与批间的准确度、精密度考察(补骨脂素、异补骨脂素1、13.5、291.6ng·mL回收率的测定因为质谱检测存在的基质效应，会影响到常规的回收率的确定，因此按照如下所述进行考察。应用空白血浆加入待分析化合物之后进行前处理的样品与空白血浆进行前处理再加入待分析化合物之后同浓度样品的待分析化合物的峰面积比值考察方法的回收率；应用空白血浆进行前处理再加入待分析化合物之后样品与乙腈-水(20∶80)复融溶液配制的同浓度样品的待分析化合物的峰面积比值考察基质效应。回收率与基质效应均考察各化合物3个质控浓度，每浓度质控样品6个重复样。4个化合物回收率在88.65%～106.4%,基质效应在88.87%～101.5%,见表2。冻融循环溶液考察低、中、高浓度质控样品在不同工作条件下的稳定性：室温下放置4h、进样盘6℃放置24h、-70℃-室温冻融循环3次、-70℃冰箱中放置30d。稳定性样品中化合物浓度偏离标示浓度(bias)不超过15.0%,稳定性试验结果见表3。药动学分析及数据处理SD大鼠20只，雌性各半，分为2组，分别为单次给药组和连续7d多次给药组。补骨脂水提液给药剂量为6g·kg用建立的分析方法对大鼠血浆样品进行分析，所得的各化合物不同时间点的浓度数据用Phoenix®WinNonlin®7.0软件(美国)非房室模型分析处理，计算药动学参数。应用MicrosoftExcel处理数据，实验数据用均数±标准差大鼠单次灌胃给药补骨脂提取物后，补骨脂素和异补骨脂素的平均达峰时间(大鼠连续7d灌胃给药，末次给药补骨脂提取物后，补骨脂素和异补骨脂素的平均达峰时间(补骨脂提取物的药代动力学特征本研究建立了同时测定大鼠血浆中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷和异补骨脂苷4个活性成分的UPLC-MS/MS分析方法，应用该方法研究了单次和多次给药补骨脂提取物后大鼠体内补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷及异补骨脂苷的药代动力学特征。研究结果表明，虽然提取物中补骨脂素和异补骨脂素的含