蛋白质理化性质

蛋白质理化性质第一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一1.蛋白质第一节蛋白质的理化性质第二节蛋白质的测定第二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一ProteinsProteinsarenotjustpolypeptides-Theyarepolypeptidesofdefinedsequence.Eachproteinhasadefinedorderofaminoacidresidues.Aswithnucleicacids,thissequenceisreferredtoasthePRIMARYSTRUCTUREoftheprotein.第四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一PrimaryStructureProteinsarelongpolypeptides.Proteinsequencescanvaryamongspeciesandstillperformthesamefunction.Proteinsevolve,andtheyevolvebychangesintheiraminoacidsequences.Conservativechanges,e.g.DforENonconservativechanges,e.g.DforA第五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一TheGeneticCodeEveryoneshouldatleastbefamiliarwithhowtoreadthefollowingtableandconvertagenesequencetoaproteinsequence.threenucleotidescodeforoneaminoacidinaprotein(43=64),sothereisroomforredundancyinthegeneticcodemRNAcodonwritten5´to3´第六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

蛋白质的理化性质（一）蛋白质的相对分子量蛋白质是生命大分子物质，其分子量很大，从一万到几百万或更大。利用测小分子法不可能。第七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一一、由化学组成测定最低分子量如血红蛋白：55.84（Fe)×（100/0.34）(含量）×4（个数）＝67000第八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一二、物化法测定蛋白质分子量：测扩散系数、渗透压、光散射、沉降超离心、凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。第九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）

x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）第十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一原理：－－颗粒：沉降－扩散，大颗粒沉降快，小颗粒慢，分离，检测。第十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系M=——————RTsD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系数第十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。？等电点两性解离比氨基酸复杂：可解离的侧链R基；对结合蛋白质，辅基部分含可解离基团。（二）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。第十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一胶体定义：质点分散系统蛋白质分子的颗粒直径已达1－100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：－蛋白质分子表面的水化膜（分子表面极性R基而结合的一层水分子）－表面电荷（同样pH下，电荷相排斥）－－－蛋白质不会聚集沉淀（三）蛋白质的胶体性质第十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；

2）带相同电荷。++++++第十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（四）蛋白质的沉淀反应1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂3.加重金属盐第十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一稳定是暂时有条件的。在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性。（五）蛋白质的变性和凝固第十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。

变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。第二十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第二十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。(变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。)因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。沉淀和凝固第二十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一引起蛋白质变性的因素有：

①物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；②化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。第二十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一①物理性质：溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。第二十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

蛋白质变性的可逆性：－－蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的；－－如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。第二十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一核糖核酸酶的变性与复性

第二十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（六）紫外吸收性质可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。原理第二十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一组成天然蛋白质分子的20种氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右。各种蛋白质中这几种氨基酸含量差别小。？含量特别，核酸干扰：280/260nm吸收差法第二十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（八）成盐反应R—CH—COOH+HClNH2R—CH—COOHNH2·HCl（九）酰基化和烃基化反应R—CH—COOH+RX′NH2R=酰基或烃基′R—CH—COOH+HX′NHRX=卤素（Cl、F）第二十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

（七）蛋白质的颜色反应—OHN第三十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（十）成酯反应R—CH—COOH+C2H5OHNH2R—CH—COOC2H5NH2HCl气当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。（十一）酰氯化反应Y—NH—CRH—COOH+PCl5酰化氨基酸Y—NH—CRH—COCl酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。第三十一页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（十二）成酰胺反应H2N—CHR—COOC2H5+HNH2体外无水H2N—CHR—CONH2+C2H5OH氨基酸酰胺有机体内：Asp（Glu）+NH4+Asn（Gln）Asn（Gln）合成酶ATP（十三）脱羧反应H2N—CHR—COOH脱羧酶CO2+RCH2NH2胺第三十二页，共四十六页，编辑于2023年，星期一（十四）迭氮反应H2N-CHR-COOHYHN-CHR-COOH酰化氨基酸YHN-CHR-COOCH3酰化氨基酸甲酯NH2NH2（-CH3OH）YHN—CHR—CO—NH—NH2酰化氨基酸的肼衍生物HNO2YHN—CHR—CON3+2H2O酰化氨基酸迭氮第三十三页，共四十六页，编辑于2023年，星期一

蛋白质的分析测定目的蛋白质含量蛋白质纯度分子量方法凯氏定氮法电泳电泳双缩脲法质谱凝胶色谱

Folin-phenol法色谱质谱

UV吸收法

Coomassieblue法

第三十四页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第三十五页，共四十六页，编辑于2023年，星期一第三十六页，共四十六页，编辑于2023年，星期一原理：消化氮--无机氮—测氮—计算蛋白含量操作：蛋白质+H2SO4

（消化）---

NH4

+加上OH-,蒸馏出NH3

收集到非挥发性的标准酸中,然后返滴定凯氏定氮法(1883)

第三十七页，共四十六页，编辑于2023年，星期一优点:对所有蛋白质的测量都是一致的(几乎全部)消化样品不要可溶缺点:装置需要大量的样品.耗时,繁琐.不是检测蛋白质–而是检测N(核酸和硫酸铵盐是严重的污染物).由于缺乏专一性需要校正。

(假定蛋白质含16%的氮,没有其它NH4

+的主要来源物存在)第三十八页，共四十六页，编辑于2023年，星期一双缩脲法（1935）原理:

两个或者以上的肽键(双缩脲是一种两个尿素分子共用一个氮原子形成的化合物–与二价铜离子形成紫红色络合物)

操作：肽+Cu2+(碱性条件下)

肽*Cu++-红色.在A540/560nm测量。绘制标准曲线，计算。第三十九页，共四十六页，编辑于2023年，星期一颜色反应原理实例双缩脲反应是两分子尿素经加热放出一分子NH3而得到的产物。凡含有两个或以上肽键结构的化合物都具有此反应。第四十页，共四十六页，编辑于2023年，星期一优点:简便，快速专一不受蛋白质特异性影响缺点:灵敏度较低必须绘制标准曲线所需样品量大

(0.2—1.7mg/ml)第四十一页，共四