蛋白质的稳定性和稳定化

蛋白质的稳定性和稳定化第一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第一节:蛋白质的稳定性一.蛋白质稳定性的分子原因蛋白质的稳定性:蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力。第二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一维持蛋白质结构稳定的主要因素:

1.金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用

金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处），因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其他低相对分子质量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。第三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

2蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用

由于蛋白质分子表面上既有疏水簇，也有极性和带电基团。从热力学上看，疏水簇与水的接触对蛋白质稳定性是不利的。所以当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域。第四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

3.盐桥和氢键

盐桥：当一个氨基酸的氨基和与它空间相邻的另一个氨基酸的羧基互相靠近时，形成盐桥。

-COO.......H3N-

蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质的稳定性作用很显著。第五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

氢键：是通过氢原子参与成键的特殊形式的化学键。当一个电负性较强的原子与氢键合后，继续与另一个电负性较强的原子键合：

氢键能维持二级结构(如α-螺旋，β-片层，β-转角等）。但是氢键对蛋白质稳定性的重要性不应估计过高。

第六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

4.二硫键

二硫键：即S－S键，是2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。链内二硫键和链间二硫键：

第七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一由于交联即蛋白质中形成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低，从而增加蛋白质的稳定性。与此类似，用双功能试剂实现分子内交联，也能使蛋白质构象稳定化。第八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

日常生活中的烫发和发型保持，主要原理是操纵毛发角蛋白二硫键的还原和再氧化，即二硫键的断开和重新键合。第九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

5.对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低

蛋白质中一些结构比较重要的氨基酸残基（如活性部位的氨基酸）的氧化作用是蛋白质失活的重要原因。因此要减少这类对氧化修饰敏感的氨基酸含量，从而提高蛋白质的稳定性。第十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一6.氨基酸残基的坚实装配溶液中的蛋白质似乎装配紧密，其紧密程度类似于低相对分子质量化合物的晶体状态，尽管如此，蛋白质结构中仍有空隙。空隙中充满水分子，会导致蛋白质不稳定，因此除去孔隙中的水分子，蛋白质结构变得更坚实，稳定性也增加。第十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一7.疏水相互作用疏水性大小与稳定性没有必然的联系非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:1.降低蛋白质表面的疏水性；

2.增加蛋白质内部的疏水性第十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一有3个主要因素不利于疏水相互作用：

1.蛋白质球体中的氨基酸必须相当紧密地堆积；

2.影响氨基酸几何形状和能量的微环境；

3.蛋白质多肽链折叠时需要疏水簇仍保持在蛋白质表面，因为在体内，疏水簇负责蛋白质与其他分子的疏水相互作用。第十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一二.测定蛋白质稳定性的方法比较蛋白质稳定性的准则包括:1.熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的变性剂浓度2.蛋白质自由能;3.最大稳定性温度(Ts);4.在特定温度下蛋白质功能活性维持时间.第十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一熔化温度Tm和蛋白质伸展50%时的变性剂浓度是预测酶稳定性的最有用参数;1.Tm:

蛋白质受热伸展过渡中点时的温度;2.变性剂浓度:蛋白质加变性剂伸展过程中使蛋白质伸展一半时所需要的变性剂浓度;第十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第二节：蛋白质失活的原因和机理一.蛋白水解酶和自溶作用

1.酶在使用和贮存过程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的结果。蛋白水解酶可催化肽键水解。

2.当蛋白质底物也是一种蛋白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫做自溶。第十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一二.聚合作用：蛋白质发生可逆性伸展→→伸展的蛋白质分子彼此缔合

→→可能发生蛋白质分子间二硫键的形成从而使蛋白质沉淀析出.

第十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质的聚合作用和沉淀的区别：

1.蛋白质的聚合作用可能是可逆的,并不一定是不可逆的.

2.沉淀作用意味着蛋白质并未发生显著的构象变化即从溶液中析出。因此，沉淀很容易再溶于水溶液中，并恢复其全部天然特性。第十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

三、极端pH:

极端pH下引起蛋白质变性的重要因素是：一旦远离了蛋白质的等电点的，那么蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展。从而使埋藏在蛋白质内部非电离残基发生电离，导致失活。

pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.第十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一四、氧化作用:

各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基，从而使蛋白质变性。分子氧、H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。五、表面活性剂和去污剂

表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈.第二十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一六、变性剂：

1.脲和盐酸胍:机制尚不明确,可能是消除了维持三级结构的疏水作用力或直接与蛋白质分子作用.

2.高浓度盐：高浓度盐既有稳定作用也有变性作用，这要看盐的性质和浓度。

3.螯合：常常不可逆地失活需要金属辅因子的酶，但可稳定不需要金属辅因子的酶；

4.有机溶剂：改变溶液的介电常数;增加疏水核的溶解度,降低带电表面的溶解度;夺去酶分子表面的必需水而使酶失活.第二十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一七、重金属离子和巯基试剂:

与蛋白质的巯基、二硫键以及色氨酸、组氨酸残基反应。八、热:

热失活是工业上最经常遇到的酶失活的原因.热失活分二步过程:伸展---不可逆失活.九、机械力：

振动、剪切、超声波、压力都可能引起蛋白质的变性。这种变性理论上是可逆的，但也可能伴随着其他反应而不可逆地失活.

第二十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一十、冷冻和脱水：

冷冻和脱水时，溶质被浓缩，引起酶微环境中pH和离子强度的剧烈改变，减弱疏水相互作用,并可能引起二硫交换和巯基的氧化。十一、辐射作用:

辐射可产生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或间接地作用于蛋白质分子.第二十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第三节蛋白质的稳定化

酶的稳定化方法

固定化非共价修饰化学修饰④蛋白质工程第二十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一一固定化固定化可通过下列效应影响酶的稳定性：

空间障碍：由于空间障碍可以防止蛋白水解酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶

扩散机制:使酶发生交联或包埋在载体紧密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。第二十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一一酶固定到载体上后可产生空间障碍，结果其他大分子难于与酶作用，因此，固定到载体上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，这也是防止蛋白水解酶自溶的原因二底物、配体和氢离子浓度在载体附近和整体溶液之间的分布不均一，造成载体周围的局部浓度与整体浓度不同，也就是酶的微环境发生了变化第二十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一三当酶包埋在多孔颗粒内，底物必须先扩散到颗粒表面（外部质量传递），然后进入颗粒内部（内部质量传递），酶才能与其作用，这些扩散限制可明显使固定化酶“稳定化”外扩散：底物必须从流动的水溶液传递到固定化酶颗粒外表面内扩散:底物进一步传递到固定化酶颗粒内部第二十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一四将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或将酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。

A

B

CA.用多功能试剂交联；B.共价或非共价连于载体上

C.包埋到载体的紧密孔中

第二十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

二、非共价修饰反相胶束添加剂蛋白质间非共价相连，形成的多聚体或者聚合体的活力和稳定性常比单体高第二十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

反胶束是由两性化合物在占优势的有机相中形成的。它不仅可以保护酶，还能提高酶活力，改变酶的专一性。

反相胶束示意图

第三十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一添加剂专一性底物及配体;非专一性中性盐和多羟基物质;与失活剂竞争的物质或除掉破坏化学催化剂的物质第三十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一添加剂不仅可以提高酶的热稳定性，还可提高酶的抗蛋白水解，抗化学试剂，抗PH变化，抗变性剂，抗稀释作用

例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羟基化合物，能形成很多氢键，并助于形成“溶剂层”，增加表面张力和溶液黏度，这类添加剂通过对蛋白质的有效脱水，降低蛋白质水解作用而起稳定酶的作用第三十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质非共价相连蛋白质间相互作用时，由于从蛋白质表面相互作用区域排除水，因而降低自由能，增加蛋白质的稳定酶形成的多聚体或聚合体的活力和稳定性也常比其单体高

第三十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一三、化学修饰化学修饰即修饰作用可达到稳定酶的作用，得到可溶性稳定化酶。

1.可溶性大分子修饰酶：聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白蛋白，多聚氨基酸

2.小分子修饰酶第三十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一原因：修饰有时会获得不同于天然蛋白质构象的更稳定的构象；修饰关键功能基团也会达到稳定化；由化学修饰引入到蛋白质的新的功能基团有可能形成附加氢键或盐键；用非极性试剂修饰可加强蛋白质中疏水相互作用；蛋白质表面基团的亲水性；交联酶晶体第三十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一酶的失活和再活化对于可逆性酶，可以采取相应措施实现其再活化例如：用过量的碘离子使脲酶重新天然化，该酶失活是由于重金属阳离子使巯基中毒引起，再活化的机理是碘离子与结合的金属离子形成碘结合物

对于不可逆变性酶，可用下述方法进行再活化：用变性剂使固定化酶伸展成无规则盘绕状态第三十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一最新进展可将变性的蛋白质分子孤立在反胶束内，蛋白质在反相胶束内可重新折叠成天然状态，而且没有与其他变性分子接触和聚合，此胶束由表面活性剂稳定的水滴构成，并悬浮于异丁烷中。第三十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第四节各种酶稳定化方法的比较比较各种不同的酶稳定化方法是困难的，因此制定的了一下一般的标准：①稳定性至少要增加1~3个数量级②应对各种酶失活因素(物理，化学及生物学因素)③稳定化不应减少酶活力或改变酶的专一性④稳定化方法适合各类蛋白质⑤稳定化方法应在体内，体外都适用⑥从经济角度看，方法应具有方法的潜力第三十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质工程定义以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质。第五节蛋白质工程第三十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一蛋白质工程的基本目标：

是按预期的结构和功能，通过分子设计和DNA重组技术，对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建并最终生产出性能比天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。优点：提供了有目的改变酶性能的可能性，不仅改变酶的结构，也可以改变其催化活力及专一性和稳定性。第四十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一改变蛋白质稳定性的蛋白质工程方法

①DNA改组技术②定点突变技术③组合设计④理性设计第四十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期一DNA改组技术的定义

DNA改组(DNAshuffling),也称分子育种(molecularbreeding)或有性PCR(sexualPCR),是以单个基因或多个同源基因(一般为天然存在的基因家族)为模板,将其切割成一系列随机大小的DNA小片段,然后在体外通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)将这些片段随机重组成全长基因,实现同源基因重组,达到分子进化目的的一种技术。第四十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期一随着突变方法、突变体高通量筛选技术、基因结构与功能研究的突破，特别是PCR技术的进一步成熟，DNA改组技术(DNAshuffling)更加成熟，使得DNA改组成为蛋白质体外分子进化的主流技术。DNA改组技术具有许多重要优点，例如不需要事先了解结构信息，也不需要了解蛋白质的功能关系，其缺点是需要配合快速、可靠的鉴别突变体的方法。第四十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期一定点突变技术(Site-directedmutagenesis)是在已知蛋白质中取代、插入或删除特定的氨基酸残基，从而改变蛋白质的结构和对应功能，又被称为理性设计(rationaldesign)。它可以作为DNA改组技术的有益补充，是基于基因和蛋白质信息进行基因和蛋白质序列的改造，通过定点突变使得所表达的蛋白质产生相应的特征改变。第四十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

组合设计（combinationaldesign）和数据驱动设计（data-drivendesign）是另外两种最新的可以提高蛋白质稳定性的蛋白质工程技术。第四十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

组合设计:

是通过一种策略使得在基因水平上产生差异化，同时，通常需要大量的高通量筛选来鉴别设计是否获得成功。组合设计方法的目标在于通过在蛋白质随机位点引入随机突变（randommutation）来提高蛋白质的稳定性。

第四十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期一组合设计方法的优点：在于不像理性设计那样需要详细的蛋白质残基信息和知识。不过，从大量的组合产生的变异体集合中，有效鉴别稳定性提升的蛋白质是极为重要的，因此筛选工作非常重要。第四十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期一数据驱动设计：

以不断增加的、相同功能的氨基酸序列以及核苷酸的可用性为基础的。它通过利用有效的数据来选择蛋白质的目标区域，减少数据库数量，而不需要指出精确的变化。

第四十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期一

数据驱动设计的优点：通过将理性设计方法的小数据库数量和缺乏设计突变所需要的指定信息合并，数据驱动方法最近被用来促进筛选过程。通过考虑可获得的有用数据（如结构和序列信息），减少序列空间，筛选变体数量。第四十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期一第六节蛋白质糖基化蛋白质的糖基化修饰是广泛存在于真核生物细胞内的蛋白质修饰形式之一，在决定蛋白质功能以及保护蛋白质免受热力学降解方面发挥重要的作用。蛋白质糖基化的分类：①O-糖基化②N-糖基化第五十页，共五十六页，编辑于2023年，星期一糖基化位点的确定方法①PNGaseF酶法

当前，因操作方法极为稳定，被应用最为广泛的N-糖蛋白鉴定方法就是PNGaseF酶法。其原理是当天冬酰胺转变为天冬氨酸时，相对分子质量会增加0