药物定量分析与分析方法验证()

药物定量分析与分析方法验证()第一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二目的和要求1、掌握定量分析方法验证的主要内容；2、熟悉生物药品前处理的主要方法；3、了解生物样品的富集方法。第二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三节药品分析方法的验证药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应样品分析的要求。在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；药品生产工艺变更、制剂的组分改变或原分析方法进行修订时，质量标准分析方法也需要验证。方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。第四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三节药品分析方法的验证（续1）需验证的分析项目有：鉴别试验；杂质定量或限度检查；原料药或制剂中有效成分的含量测定；以及制剂中其他组份（如防腐剂等）的测定。药品溶出度、释放度等检查中，其溶出量等的测试也要做验证。第五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三节药品分析方法的验证（续2）验证内容有：准确度；精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）专属性检测限、定量限线性、范围耐用性等。第六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（Accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的“范围”内测试。“范围”指的是确定的测试方法适用的高低限浓度或量的区间。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证第七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续1）（一）含量测定方法1、原料药的测定原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定；或用本法测定供试品的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。计算公式：第八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续2）如果该分析方法已经测试，并求得其精密度、线性和专属性，在准确度可以推算出来的情况下，准确度可以不用再验证。2、制剂的含量测定主要测试制剂中其他组份及辅料对含量测定方法的影响。可用含已知量被测物的制剂各组分（包括制剂辅料）进行测定。计算公式同原料药的方法。第九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续3）如果不能获得制剂的全部组分，则可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，回收率计算公式为：中药分析回收率测定常采用此法，一般要求在95～105%之间。若有些方法操作步骤繁多，可要求在90～110%。RSD一般在3%以内。第十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续4）制剂含量测定时要考虑辅料的影响，要尽量除去辅料的空白影响。制剂分析中，要求从自行制定的模拟样品开始，要求至少高、中、低三个浓度，每个浓度3份样品，共9个数据进行分析。一般仪器分析要求回收率的RSD为2%之内，而容量分析要可达到99.7～100.3%。对于生物样品分析，要求可以适当放宽第十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续5）（二）杂质含量测定方法多采用色谱法。回收率的测定可通过向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测试。第十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、准确度（续6）（三）数据要求在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。如设3个不同浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定。应报告已知加入量的回收率（%）计算值，或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差（RSD）或可信限。第十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、精密度（Precision）精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或相对标准偏差（RSD）表示。一般至少用6次结果进行评价精密度。精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人员、实验室等所得结果的重现性和重复性。涉及含量测定的项目（含量测定和杂质定量）都需要验证精密度。第十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、精密度（续1）偏差（d）：测量值与平均值之差标准（偏）差（SD或S）相对标准（偏）差（RSD）第十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、精密度（续2）（一）验证内容精密度验证包括重复性、中间精密度和重现性1、重复性：在较短时间间隔内，在相同操作条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性，也称批内精密度。测定时，可采用3个不同浓度，每个浓度3份供试品，共9个数据进行分析。也可以采用同一个浓度，用6个数据进行分析。第十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、精密度（续3）2、中间精密度在同一实验室，由于实验室内部条件的改变，如不同时间、不同分析人员，用不同设备测定所得结果的精密度，称为中间精密度。3、重现性在不同实验室，由不同分析人员测定结果的精密度，称为重复性。重现性只有当方法被法定标准采纳时需要做第十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第二十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二三、专属性（Specificity）专属性是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，也是用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。鉴别反应、杂质检查、含量测定等均应考察专属性。如果方法的专属性不够好，需要采用多个方法进行补充。第二十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第二十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二三、专属性（续1）（一）鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应成负反应。（二）含量测定和杂质测定应用色谱法时，应附代表性图谱并应标明诸成分在图中的位置，以说明专属性，其中分离度应符合要求（>1.5）。第二十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二三、专属性（续2）对于可获得杂质情况下，可通过加入杂质的方式，看杂质是否可得到有效分离。对于杂质不能获得的情况，可与其他已经验证的方法进行比较。必要时采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行纯度检查。第二十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第二十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二四、检测限（LimitOfDetection，LOD）检测限是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。反映了方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白值的高低。LOD是一种限度检查效能指标，无须准确定量，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可药品的鉴别试验和杂质检查方法均应验证LOD第二十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二四、检测限（续1）（一）常用方法1、目视法用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物最低浓度或量。该法通常为仪器分析法中LOD的确定。2、信噪比法用已知浓度的样品信号与空白样品的信号进行比较。一般以信噪比S/N=3时确定LOD。第二十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第二十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二五、定量限（limitofquantitation，LOQ）LOQ是指样品中被测物能被定量测定最低量，其测定结果应该具有一定的准确度和精密度。LOQ的方法与LOD相似，只是信噪比一般要大得多，其S/N=10。也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定。第二十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二六、线性（Linearity）线性系指在设计的“范围”内，测试结果（响应值）与样品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。应在规定的“范围”内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的样品。以测得的响应值作为Y，药物浓度为X，先作图；然后用最小二乘法进行线性回归分析。必要时，将响应值进行数字换算后再计算。第三十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二六、线性（续1）一般要求回归方程的相关系数越接近于1，表明线性关系越好。但对于生物样品来说，要求会低些。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。第三十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第三十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二七、范围（Range）范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对范围也有不同要求：对原料药和制剂，范围为80～120%；制剂含量均匀度为70～130%，也可以根据剂型特点适当选择。如果规定了限度范围，一般为上限的+20%到下限的-20%。第三十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二七、范围（续1）首先给定浓度范围，即样品浓度（或质量）取值的最大和最小值，也是分析时样品浓度（质量）的上限和下限；线性指的是在给定范围内样品测定信号与其浓度之间成正比的程度。一般以作图的方式或者回归方程的形式表示。线性与范围一般不分开。第三十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二八、耐用性（Robust）耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。指的是对于影响条件变化时的适应程度，应尽可能的宽松，有一定的缓冲能力。第三十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二八、耐用性（续1）典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。第三十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二方法学验证的选择精密度准确度检测限定量限专属性线性范围耐用性鉴别试验：

杂质含量测定：

溶出度和药物释放度：

生物样品含量测定：

杂质限度检查：原料药主要成分含量测定：

制剂中主要成分含量测定：

第三十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第四节生物样品分析方法的基本要求生物样品的前处理非常重要，除少数情况下样品经简单处理后进行测定外，大部分情况下都需要对样品进行适当的处理，即进行分离、纯化和富集等，必要时还需要对待测组分进行衍生化处理，以满足分析目的和定量分析方法的各种要求。第三十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二一、常用样品的种类、采集和贮藏生物样品包括各种体液和组织，最常见的是血液样品，其次是唾液和尿液，在做组织分布时组织样品也很常用。（一）血样（二）唾液（三）尿液第四十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）血样（Blood）血样包括血浆、血清和全血。血药浓度主要指血浆或血清中的药物浓度，而不是全血中的药物浓度。一般认为，当药物在体内达到稳态平衡时，血浆中的药物浓度能够反映药物在体内靶器官的浓度（但可反映多少呢？），因而常把血浆药物浓度作为体内药物浓度的测定指标。第四十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）血样（续1）血样的采集：对于患者来说，通常采用静脉取血方式；对于动物来说，可以采用更灵活的方式，如静脉、动脉、心脏等。一般不能取太多血样的制备：全血：取全血后，加入凝血剂（肝素、枸橼酸钠等）防止凝结，不进行离心操作。第四十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第四十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）血样（续2）血浆（Plasma）的制备：将加了抗凝剂的全血混匀后，以2500～3000RPM离心5～10min，使得血浆与血细胞分离，其中的淡黄色上清液即为血浆。血清（Serum）的制备：将采集的血样在室温下放置0.5～1hr，带血液凝固后，用玻璃棒轻轻剥离雪饼，然后以2000～3000RPM离心5～10min，分取上层的淡黄色液体即为血清。第四十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第四十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）血样（续3）血浆与血清相比，它们的药物浓度测定值基本相同，但是血浆分离的比较快，而且制取的量约为全血的50%~60%（血清只为全血的20%~40%），多数研究者用血浆进行分析测定。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测等需要知道相对确切药物浓度的分析中。第四十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）血样（续4）血样采取后，应及时分离血浆和血清，否则血细胞破裂而发生溶血，导致药物与各种蛋白等结合，致使无法测定。如果可以，最好及时分析血样。若不能立即测定，需要放置试管中密塞保存。短期（一周内）可放在冰箱中保存（4度左右），长期保存需在-20或-80度冷等保存。全血不宜低温冷冻保存。第四十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（二）唾液唾液的分泌量相对较大，而且其获取较血液容易得多，而且有些药物的唾液浓度与血浆浓度密切相关，所以有时也采用唾液进行测定。唾液的采集应在安静状态下，漱口15min后采集。采集后去掉泡沫部分，然后在3000RPM离心10min，取上清液使用。唾液采集后，应在4度以下保存。在解冻时，需要充分搅匀后使用，避免浓度不均匀。第四十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第四十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（三）尿液药物的清除主要通过尿液排出。尿液中可存在药物的原形、代谢物和缀合物等，浓度高，量大，采集方便。但尿液中药物浓度变化较大。所以，其应用的目的与血样有区别，主要在药物剂量回收、肾清除率、生物利用度以及药物代谢等方面的研究。尿的主要成分是水、尿素和各种盐类等。不宜长期放置，而且需要加入防腐剂保存。第五十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二第五十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（三）尿液（续1）尿液浓度与血浆浓度没有明显的相关性。受到肾功能的影响比较大。一般收集采用自然排尿的方式，包括时尿、晨尿等几种形式。测量每次收集的尿液体积，分别或集中收集（集中收集应测量总体积），加防腐剂后保存。第五十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、生物样品分析前处理技术生物样品的前处理，需要考虑到如下几方面：生物样品的种类；被测物的性质、存在形式和浓度范围；所采用的测定方法。第五十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、生物样品分析前处理技术（续1）1、生物样品的种类生物样品的种类不同，需要进行处理的过程也有差异。血浆和血清需要去除蛋白质的干扰，使得药物才蛋白质结合物中释放出来；唾液样品相对简单，离心去除粘蛋白即可；尿液常用酸或酶水解使得药物从缀合物中分离出来。第五十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、生物样品分析前处理技术（续2）2、被测药物的结构和性质，以及存在形式和浓度范围等都对前处理有直接影响。药物的酸碱性与溶解性涉及到药物的萃取手段是否具有挥发性等可以考虑GC的分析；光谱特性和官能团性质涉及是否需要衍生化；浓度的高低也需要处理方法要求的高低等。第五十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二二、生物样品分析前处理技术（续3）3、采用的测定方法不同，对于样品前处理的要求也不同。HPLC方法对于去除蛋白是必须要求的；样品浓度的高低也决定去除蛋白的方法也不相同；GC对于是否需要制备衍生物有要求；光谱分析法则需要为纯物质，所以要求更高；放射免疫法的专属性很高，对于样品的处理也相对简单得多。第五十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除目的：使得药物从结合型变成游离型，便于分析；减少后续处理过程中萃取时的乳化现象；保护仪器性能，避免造成损失，延长寿命。常用方法：加入与水混溶的有机溶剂；加入中性盐；加入强酸；加入含锌盐或铜盐沉淀剂；酶解法。第五十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除（续1）1、加入与水相混溶的有机溶剂有机溶剂的加入可以使得蛋白质分子内部及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，从而使得药物得以释放出来。常用的有机溶剂有：乙腈、甲醇、丙酮和四氢呋喃等。常用的比例为：血浆/有机溶剂=1：1～1：3，可以去掉90%以上蛋白质。用乙腈做沉淀剂效果较甲醇更好些。而离心时的速度需要达到10000RPM及其以上。第五十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除（续2）2、加入中性盐：加入中性盐，使得盐浓度增加，蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐和枸橼酸钠等。常用比例为：血浆/饱和硫酸铵=1：2混合后，高速离心，可去除90%以上蛋白质。常与有机溶剂萃取法联用，以提高效率。第五十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除（续3）3、加入强酸：当溶液的pH低于蛋白质的等电点，蛋白质为阳离子状态，可与酸根阴离子结合而形成沉淀析出。常用的强酸有10%的三氯乙酸（或三氟乙酸）等，比例为血浆/强酸=1：0.6左右混合，高速离心后，可去除90%以上蛋白质。第六十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除（续4）4、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂：当pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带负电荷的羧酸与金属阳离子形成不溶性沉淀常用的沉淀剂有：CuSO4和ZnSO4等，混合的比例为血浆/沉淀剂=1：2，然后高速离心。第六十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（一）蛋白质的去除（续5）5、酶解法：在测定某些与蛋白质结合牢固、且对算不稳定的药物时，常加入一些酶而使得蛋白质分解，将药物释放出来。常用的是枯草菌溶素。但也可以根据药物的不同选择合适的分解酶。该法操作简单，效果较好。但很多酶的价格很高，且不易获得是其缺点。第六十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（二）缀合物的水解药物进入体内后，被免疫系统当作异物而代谢掉，其中一些含有羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性的葡萄糖醛酸或葡萄糖酸酐等结合，形成极性大的无活性的缀合物。在测定尿液中药物的总量时，需要用适当的方法水解，然后再进行测定。其中酸水解法简便、快速，但专一性差、药物易分解；酶水解法专一性较强、药物无分解；但时间长、费用大，对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法。第六十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（三）有机破坏生物样品中的金属原子常与蛋白质结合，难以用有机溶剂萃取，测定时多采取有机破坏的方法进行，如使用硝酸-高氯酸作为消解剂，将有机部分破坏掉，使得金属原子被转变成高价态的离子部分。第六十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（四）分离、纯化和富集样品的浓度高低对于前处理的影响很大。如果样品浓度较高（ug/ml及其以上），所采用的方法灵敏度可达到要求，那么样品在简单处理（如沉淀蛋白或缀合物水解）后即可直接进行测定。在很多情况下，生物样品中药物的浓度很低（ng/ml及其以下），很多仪器条件（如UV检测）的灵敏度不够，此时需要将样品进行分离、纯化和富集，以达到分析的要求。第六十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（四）分离、纯化和富集（续1）萃取法是应用最多的分离、纯化方法。目的是从大量样品中提取出所需要的微量组分，然后通过溶剂的蒸发而使得样品得到富集。萃取方法包括：液液萃取法：经典方法；液固萃取法；发展迅速方法。第六十六页，共八十二页，编辑于2023年，星期二1、液液萃取法（LLE）液液萃取法（Liquid-Liquidextraction，LLE）适用于极性相对较小的药物，由于这些药物在有机溶剂中的溶解度（远远）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多数内源性物质极性较大，根据相似相溶原理，可以用有机溶剂将小极性药物从水相中萃取出来，同时可以除去大部分的干扰物质，包括大量蛋白质等。该方法是传统方法，仍在大量使用。第六十七页，共八十二页，编辑于2023年，星期二1、液液萃取法（续1）LLE需要考虑有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积，以及水相的pH值等。所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大（能提取完全），沸点低（易于蒸发或挥发除去），与水不相混溶（容易分离）、无毒（苯类溶剂不要用）、化学稳定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影响萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先难以购买，可用二氯甲烷替代）。第六十八页，共八十二页，编辑于2023年，星期二1、液液萃取法（续2）所用的有机溶剂要适量，一般有机相与水相（液体样品）的容积比为1：1或2：1，也可根据实际情况进行确定。如果有机溶剂体积过大，后续的挥发时间较长；体积过小，则可能提取不完全，影响测定结果的准确性。第六十九页，共八十二页，编辑于2023年，星期二1、液液萃取法（续3）溶液的pH值对与LLE的影响非常大。多数药物是亲脂性的碱性药物，内源性物质多为酸性，所以在碱性条件下提取药物，可以使得药物呈原型状态而被易于提取出来，而内源性物质则留在水相中。可用适当碱性溶液（如碳酸氢钠-氢氧化钠的混合液作为碱化试剂）一般情况下，有机溶剂的萃取只萃取一次。第七十页，共八十二页，编辑于2023年，星期二1、液液萃取法（续4）LLE的优点是选择性好，操作简单，成本低。大多数的药物都可以与内源性物质得以分离，对结果的干扰较小。但该法不适合于极性大的药物的分离和纯化。第七十一页，共八十二页，编辑于2023年，星期二2、液固萃取法（LSE）液固萃取法（Liquid-Solidextraction，LSE）是近年来发展非常迅速的方法，主要采用柱色谱分离方法，将具有吸附、分配和离子交换性质的固定相作成萃取小柱，将生物样品通过此小柱，可以用适当溶剂将干扰物洗脱掉，将药物保留在固定相上，再用适当的溶剂洗脱下来进行分析。第七十二页，共八十二页，编辑于2023年，星期二2、液固萃取法（续1）LSE的特点：引入杂质较少，样品洗脱后可直接分析；消除在LLE中常见的乳化现象；萃取效率高，可用少量样品进行分析；最后洗脱多为以水为主的溶剂，安全性高；样品处理速度快，对挥发性和热不稳定性药物更合适；缺点是价格高，有时重复性差。第七十三页，共八十二页，编辑于2023年，星期二3、被测组分的富集样品的萃取是一个去除杂质的纯化过程，但因为此时有机溶剂的体积较大导致药物的浓度较低，一般情况下不能直接用于分析。还需要进一步的富集。富集的方法一般为：最后一次萃取的溶剂为小体积，使得药物的浓度可达到分析方法的灵敏度；或者将有机溶剂挥发，然后再用小体积的合适的溶剂（如流动相）复溶解后再分析。第七十四页，共八十二页，编辑于2023年，星期二3、被测组分的富集（续1）挥去萃取溶剂的常用方法是直接通入高纯氮气流吹干有机溶剂，药物保留在试管底部。因为氮气的性质不活泼，对于保护药物不分解有帮助。如果药物本身稳定，也可以通入干净的空气流，以减少成本。对于遇气流挥发或者遇热不稳定的药物，可以用减压法挥去溶剂（真空干燥箱），此法可同时处理多个样品。溶剂蒸发时最好采用尖底玻璃试管，可使得少量溶剂富集在底部，便于吸取。第七十五页，共八十二页，编辑于2023年，星期二（五）化学衍生化衍生