酶抑制法和免疫测定技术课件

第六章酶抑制法和

免疫测定技术学习指南观察思考课外阅读复习自测退出本章演示文稿本章目录辽农职院工程系质检中心2023年6月6日1谢谢欣赏2019-7-22目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的水平。通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫法相关的一些知识。学习要点

1、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。

2、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。

3、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术等快速测定农药残留方法等。学习指南2谢谢欣赏2019-7-22第六章酶抑制法和免疫测定技术本节首页退出本章一、酶抑制分析测定法1、酶法概述2、酶法检验原理3、酶原4、底物与显色剂5、测定方法二、免疫检测技术1、免疫反应2、免疫分析3、酶联免疫吸附测定法4、农药抗体制备5、ELISA法的特点3谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章一、酶抑制分析测定法1、酶法概述4谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒内水解，生成乙酸和胆碱。2、酶法检验原理5谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章神经性毒剂分子中含有亲电子的正磷原子(Pδ+)，它与Ach分子中的正碳原子(Cδ+)同样具有亲电子性质。但神经性毒剂的亲电子能力此Ach强，这是因为毒剂分子中，P＝O和P-F键上的O、F原子相对电负性比P原子大得多(相对电负性P＝2.1，O＝3.5，F＝4.0，C&S＝2.5)。因此，相对电负性大的O、F原子吸收电子成为负极，使P成为低电子密度的正极，即P原子带有较多的正电荷和更强的亲电子能力。所以神经性毒剂对AchE有更大的亲和力和抑制力。(1)神经性毒剂对AchE的抑制机理6谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度不同分真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前者又称乙酰胆碱酯酶(AchE)，后者包括丁酰胆碱酯酶(BuchE)和丙酰胆碱酯酶(PrchE)。假阳性：水果、蔬菜的提取物中含有对有抑制作用的杂质，如氯代烟碱类物质。(2)对胆碱酯酶的抑制作用①假阳性7谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章敌敌畏乙酰胆碱AchE②产生假阳性的作用机理8谢谢欣赏2019-7-223、酶原本节首页退出本章蜜蜂头的脑酯酶液条件：3日龄，-20℃0.24g/ml磷酸缓冲液（pH7.5）保质期：3个月9谢谢欣赏2019-7-224、底物与显色剂本节首页退出本章乙酰胆碱+H2O→胆碱+乙酸pH为6.2（黄）→7.6（蓝色）（1）乙酰胆碱-溴百里酚蓝10谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章乙酸-β-萘酯固蓝B盐+H2O→β-萘酚+乙酸（紫红色）（2）乙酸-β-萘酯固蓝B盐11谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章（3）乙酸羟基吲哚显色法乙酸羟基吲哚+H2O→吲哚酚+乙酸吲哚酚+O2→靛蓝（蓝色）12谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章（4）乙酸靛酯显色法乙酸靛酯+H2O→靛酚蓝（蓝色）+乙酸13谢谢欣赏2019-7-22水解加酶显色剂未水解显色剂不显色显色5、测定方法（1）测定原理无农药有农药14谢谢欣赏2019-7-225、测定方法加入20ml提取试剂提取

取2g样品（非叶菜类取4g），切碎取样振荡1~2min抑制反应将上清液倒入试管中，静止3min，加入50ul酶，3ml样品提取液，50ul显色剂培养倒入比色杯测定仪器测定（2）、比色法15谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章（3）、酶片法酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感酯类的滤纸片或类似载体物质，其基本技术原理与比色法相同。16谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章6、技术问题（1）分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类（2）灵敏度不高，需用GC进一步定性和定量、重现性不好（3）农药含量影响酶抑制程度（4）影响因子：酶的浓度、温度、pH17谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章二、免疫检测技术Pathogen18谢谢欣赏2019-7-221、免疫反应本节首页退出本章免疫反应：细菌、病毒→入侵→抵御的抗体，即识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。抗原：外来物19谢谢欣赏2019-7-222、免疫分析本节首页退出本章免疫分析：以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。免疫反应特点：高度选择性。20谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章3、酶联免疫吸附测定法ELISA（EnzymeLinkedImmuno-SorbentAssay)原理：在测定过程中，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。（加入显色剂）21谢谢欣赏2019-7-22（1）、直接ELISA原理AgAg*AbSPAbAb：Ag：Ag*22谢谢欣赏2019-7-22（2）、间接ELISA原理AgAb*SPAg：AbAgAg：AbAb*Ag：Ab：Ab*23谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章4、农药抗体制备Antibody（Ab）：动物肌体某些活性细胞在某些物质（抗原）刺激下产生，并能与这些物质特异性结合的一类活性物质。24谢谢欣赏2019-7-22本节首页退出本章5、ELISA法的特点（1）适用于常规方法无法测定的农药（2）适用于环