植株生理生长指标测定

根活的定TTC法植株根系是活跃的吸收器官和合成器官的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长营养状况及产量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（）标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙的三苯甲腙比较稳定被气中的氧自动氧，所以被泛地用作酶实验氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料水培或砂培小麦、玉M植物根系。（二）仪器设备分光度计分天平（感量电顶载天平（感量4.温；研钵；三瓶50ml；7.漏8.量100ml吸量管10.刻试管10ml；试架12.容量瓶；13.药；14.石英砂适量15.烧10ml、。（三）试剂、乙酸乙酯（分析纯、次硫酸钠NaS析，粉末。22、1％溶液：准确称取，溶于少量水中。定容到。、0.4％溶：准确称取TTC，溶于少量水中。定容到。、磷酸缓冲液（1/15mol/L、1mol/L硫：用量筒取比重的硫酸，边搅拌边加入盛有蒸水的烧杯中，冷却后稀释至。、0.4mol/L琥酸称取琥珀酸4.72g溶于水中，定容至即。三、实验步骤、定性测定18

（1配制反应液：把溶液、0.4mol/L的珀酸和磷酸缓冲液按比混合。（2把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置℃左右暗处放1~3h，以观察着色情况，新根尖端几毫M及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。、定量测定（1TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2ml放10ml量瓶中，加少许NaO粉匀后立即产生红色的甲腙。再用224乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液00.50ml1.00ml1.50ml2.00ml置容瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25g、50μg、μg、μ、200g的准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2称取根尖样品，放入烧中，加入％TTC溶和磷酸缓冲液的等量混合液，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温～，此后加入1mol/L硫2ml，以停止反应（与同时一白验先硫，加样，他作上（3把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯～和量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使量为10ml，用分光光度计在波长485nm下色，以空白实验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算单位质量鲜根的四氮唑还原强度C—标准曲线查出的四氮唑还原量（mgW样品质量t—应时间h植体硝还酶力测硝酸还原酶植物氮素同化的关键酶，它催化植物内的硝酸盐还原为亚硝酸盐NO+NADH+HNOO生亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基32苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产28

生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重μ氮/（g）单位。的定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定；离体法复杂，但重复性较好。Ⅰ离体一、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦或其他植物叶片、幼穗等。（二）试剂、亚硝酸钠标准溶液确称取分析纯NaNO0.9857g溶无离子水后定容至然后再取25mL定至1000mL，即为含亚硝态氮的μg/mL的准液。、0.1mol/L的酸缓冲液：HPO·12H与NaHPO·2H加无离子水24溶解后定容至1000mL1磺胺溶液1.0g磺胺溶于100mL度为3mol/L的（浓盐酸加水定容至即为3mol/LHCl、％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘乙烯胺溶于mL无子水中，贮于棕色瓶中。、0.1mol/LKNO溶：KNO溶250mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液。330.025mol/L的磷酸缓冲液HPO12H，KHPO3HO溶1000mL242无离子水中。、提取缓冲液：半氨酸0.0372gEDTA于mol/LpH8.7的酸缓冲液中。、溶：2mg于mol/LpH7.5磷缓液中（临用前配制（三）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平（感量箱恒温水浴，研钵剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。二、实验步骤（一）标准曲线制作取洁净烘干的刻试管按表顺加入试剂配～μ的列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25下保温，后在540nm比色测定。以亚硝态氮μg为横坐标X光度值为纵坐标Y）立回归方程。38

表1

配制标准溶时各物质入量管号试剂/mL亚硝酸钠标液蒸馏水磺胺0.02%萘基烯胺每管含亚硝氮μg

10440

244

344

444

544

644

744（二）样品中硝酸还原酶活力测定、酶的提取称取0.5g样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻，出置冰浴中加少石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、4000r/min下心，上清液即为粗酶提取液。、酶的反应取粗酶液0.4mL10mL试中，加入1.2mL0.1mol/LKNO磷缓冲液和0.4mLNADH溶，3混匀25水浴中保温照不加NADH溶0.4mL0.1mol/L酸缓冲液代替。、终止反应和比色测定保温结束后立即加入1mL磺溶液终止酶反应，再加萘基乙烯胺溶液，显色后4000r/min下心取清液在540nm下色测定吸光度根回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量μ三、结果计算样品中硝酸还原酶活性x—反应液酶催化产生的亚硝态总量μV—提取酶时加入的缓冲液体积，mLTV—酶反应时加入的粗酶液体积mL；W样品鲜重；t—应时间。48

Ⅱ活体一、材料、仪器设备及试剂（一）实验材料水稻、小麦或其他植物叶片、幼穗等。（二）试剂、亚硝酸钠标准溶液确称取分析纯NaNO0.9857g溶无离子水后定容至然后再取25mL定至1000mL，即为含亚硝态氮的μg/mL的准液。1磺胺溶液1.0g磺胺溶于100mL度为3mol/L的（浓盐酸加水定容至即为3mol/LHCl、％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘乙烯胺溶于mL无子水中，贮于棕色瓶中。、0.1mol/LKNO溶：KNO溶250mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液。33、30%氯乙酸溶液：30g三乙酸，水溶后定容至100mL（三）仪器设备真空泵、真空干燥器、小烧杯、玻璃瓶塞、其他用具同离体法。二、实验步骤（一）标准曲线制作：同离体法（二）酶反应及活性测定、取样：称取作物叶片4份剪成左的小段，放于小杯中，用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底，其中1份对照，另外3份做酶活性测定用。、反应：先向对照管中加入1mL三氯乙酸，然后各管中都加入0.1mol/LKNO溶液，混匀3后立即放入干燥器中，抽气通入空气，再抽真空，反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全软化沉入杯底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，℃黑暗中反，再分别向测定管（对照管除外）加入1mL三氯乙酸终止酶反应。、比色测定：将各管摇匀静置，各取反液，加入1mL磺和萘基乙烯胺，摇匀显色15min后于下离心，取上清液于540nm处其光度。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量μ三、结果计算同离体法。58

叶素量测一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度与中溶质浓度和层厚度L正比，即：式中α为比例常数当液浓度以百分浓度为单位层厚度为1cmα为该物质的吸光系数种色物质溶液在不同波下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质此合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素，叶绿素类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在个定波长下的吸光度A，并根据绿素，叶绿素类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a，叶绿素为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a叶绿素的丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为和645nm已知在波长，叶绿素a，叶绿素在该溶液中的吸光系数分别为和9.27，在长下分别为16.75和，根据加和性原则列出以下关系式：（1（2式的A和为绿素溶液在波长663nm和时吸光度Ca分为663645叶绿素、叶绿素的浓度，以mg/L为单。解方程组（1：（3（4将与相即得叶绿素总量Cab

T（5另外，由于叶绿素a叶绿素在的收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为也可以在此波长下测定一次吸光度A）而求出叶绿素、叶绿素量：65268

xx（6在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中色素含量的计算公式：（7（8（）式中：与分别为叶绿素、叶绿素的浓度；abC为类胡萝卜素的总浓度；A、A和A分别为叶绿素色提取液在波长663nm和470nm下的吸光度。663470由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异此在使用其他溶剂提取色素时计公式也有所不同。叶绿素a叶绿素在乙醇中最大吸收峰的波长分别为和，胡萝卜素为，据此列出以下关系式（10（11（12二、材料、仪器设备及试剂（一）材料新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备分光光度计、电子天平、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管。（三）试剂、95%醇（或80%酮、石英砂；、碳酸钙粉。三、实验步骤（1取鲜叶（其他绿色组织或材擦净组织表面污物打孔器剪取叶片组或剪（去78

掉中脉匀（2称取混匀后的新鲜样品0.2g共三份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉以及95%乙醇（或丙酮，以下同磨匀浆，再加95%乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置。（3取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到5mL棕容量瓶中，用少量95%醇冲洗研钵，研棒及残渣数次，最后连残渣一起倒入漏斗中。（4用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直到滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至，匀。（5把叶绿体色素提取液倒入光径的色杯内。以乙醇为空白，在波长