核酸、蛋白技术参数资料、分子量标准及常用试剂的配制

核酸、白技术参数料、分量标准及常试剂的制一、核酸及蛋白质常用数据1．苷三磷酸的物理常数化合物ATPCTPGTPUTPdATPdCTPdGTPdTTP

分子量507483523484494467507482

λmax(pH7.0)259271253262259271253267

1摩溶液（）max的最大吸收值1540090001370010000152009300137009600

OD280/OD2600.150.970.660.380.150.980.660.71核酸λDNApBR32228SrRNA23SrRNA18SrRNA19SrRNA5SrRNA

2．常用核酸的长度与分子量核苷酸数48502（双链环状）4363（链）4800370019001700120

分子量3.0×1072.8×1061.6×1061.2×1066.1×1055.5×1053.6×104

tRNA（大肠杆菌）752.5×1043．用核酸蛋白换算数据（）量换算1μg=10-6g1pg=10-12g1ng=10-9g1fg=10-15g（）光光度算：1A260双链DNA=50μg/ml1A260单DNA=30g/ml1A260单RNA=40μg/ml（）DNA摩换算：1μg100bpDNA=1.52pmol=3.03pmol末端μgpBR322DNA=0.36pmol1pmol1000bpμg1pmolpBR322=2.8g1kb双（钠盐道尔顿1kb单链DNA（盐）=3.3×105道顿单链（钠盐）=3.4×105道顿（）蛋白摩尔换算：100pmol分量100蛋白质=10μg100pmol分量，000蛋白质5μg100pmol分量，000蛋白=1μ

氨基酸的平均分子量126.7道尔顿（）白质换：1kbDNA=333个氨基酸编码容量=04MW蛋白质10，000MW蛋质270bp30，000MW蛋白=810bpDNA50，000MW蛋白质=1.35kb100，蛋白=2.7kbDNA4．常用蛋白质分子量标准参照物（）分子量标准参照

（）分子量标准参照

（）分子量标准参照肌球蛋白肌球蛋白β-半糖甘酶B磷酸化酶B牛血清白蛋白

分子量212，000116，00097，40066，200

磷酸化酶B牛血清白蛋白谷氨酶脱氢酶卵白蛋白醛缩酶

97，66，55，42，40，

碳酸酐酶大豆脻蛋白酶抑制剂马心肌球蛋白溶菌酶

31，0021，16，14，过氧化氢酶醛缩酶

57，00040，000

碳酸酐酶大豆脻蛋白酶

31，21，

肌球蛋白（F1）8，100肌球蛋白（F2）6，200抑制剂

肌球蛋白（F3）2，500溶菌酶

14，5．用DNA分子量标准参照物λDNA/HindⅢ

λDNA/EcoRⅠ

λ/HindⅢ+EcoRⅠpBR322/HaeⅢ

2313094166557436123222027564125

2122674215804564348433530

2122751484973426835302027190415841375974831

587405504458434267234213192184124

12310489806457512118117564125常用抗生素溶液贮存液

工作浓度抗生素氨苄青霉素羧苄青霉素氯霉素卡那霉素链霉素四环素b

浓度50mg/ml(溶于水)50mg/ml(溶于水)34mg/ml(溶于乙醇)10mg/ml(溶于水)10mg/ml(溶于水)5mg/ml(溶于乙)

保存条件-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃-20℃

严紧型质粒20μg/ml20μg/ml25μg/ml10μg/ml10μg/ml10μg/ml

松弛型质粒60μg/ml60μg/ml170g/ml50μg/ml50μg/ml50μg/mla：以水为溶剂的抗生素贮存液通过0.22μm滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培基）。

五、常用贮存液的配制1．30%丙烯酰胺液【制方法】

将29g丙酰胺和N’亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水热至37溶解之加水至终体积为100ml。

用Nalgene滤（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。【注意】

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体的单床混合树脂MB-1Mallinckrodt）搅拌过夜，然后用Whatman1号纸过滤以纯化之。

在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。2．40%丙烯酰胺【配制方法】

把380g丙烯酰胺（DNA测序）和20g，N亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中继按上述配制30%烯酰胺溶液的方法处理但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。【意】

见上述配制丙酰胺的说明40%烯酰胺溶液用于DNA序测定。3放线菌素D液【制方法】

把20mg放菌素D溶于4ml乙中110释贮存液，用100%乙作空白对照读取OD440值放线菌素D（分子量为1255）纯在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，而1mg/ml的放线菌素溶液440nm处吸值为0.182线菌素D的存液应放在包有箔片的试管中，保存于20℃。【意

放线菌素D是畸和致癌剂，制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长的吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。4．0.1mol/L腺三磷酸ATP溶液【配制方法】

在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH至pH值至7.0用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于70℃510mol/L乙酰液【配制方法】

把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后滤除菌6．10%硫酸铵溶液【制方法】

把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中液可在4保存数周。7溶【制方法】

把的5-溴-4-氯3-吲哚磷二钠盐BCIP）溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃8缓冲盐溶液【配制方法】

用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐液BES[N，N-（2-羟乙基-2-基乙磺酸、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4，温下用HCl调节该液的pH值至6.96、后加入蒸馏水定容至，0.22m器过滤除菌，分装成小份，保存-20℃。．1mol/LCaCl2溶【配制方法】

在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2·6H2O用μm滤过滤除菌，分装成10ml小贮存于20℃。【意】

制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100mlNalgene滤0.45μm径除菌骤至0℃。102.5mol/LCaCl2溶【制方法】

在20ml蒸水中溶解13.5g，用0.22μm滤器过滤除菌成1ml小贮存-20。硫苏糖【制方法】

用20ml0.01mol/L乙钠溶液pH5.2溶解3.09gDTT过滤除菌后分装成1ml小贮存于20℃。【意】或含有DTT溶液不能进行高压处理。12氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【制方法】

把每一种溶于水至浓度为

100mmol/L左，用微量移液器取0.05mol/lTris碱别调节每一dNTP溶的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在下表中给出的波长下读取光密度计算出每种dNTP的实浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，装成小份贮存于-70℃碱基AGCT

波长（）259253271260

消化系数（ε[L/（mol·cm）]1.54×1041.37×1049.10×1037.40×103比色杯光径为1cm时吸光度εM13．0.5mol/lEDTA(pH8.0)液【配制方法】

在水加入186.1g二水二胺四乙酸二钠EDTA-Na·2H2O）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。【意】EDTA钠盐需加入将液的pH值至接近8.0，才能完全溶解。14．化乙锭10mg/ml溶）【制方法】

在100ml水中加入1g溴化锭，磁力搅数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。【意】

小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。15．2×HEPES缓盐溶液【制方法】

用总量为的馏水溶解1.6g、KCl0.027gNa2PO4·2H2O、0.2g葡糖和1gHEPES，0.5mol/l调节pH值7.05，再用蒸馏水定容至100ml用0.22m滤器过滤除菌分装成5ml小贮存于20℃。16IPTG溶液【制方法】为异丙基硫-β-D-半乳苷（分子量为238.3）在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸水定容至，用0.22μ滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于20℃。．乙酸镁溶液【配制方法】

在800ml水溶解214.46g四乙酸镁，用水定容至过滤菌。18．1mol/LMgCl2溶【制方法】

在水溶解203.4gMgCl2·6H2O，用水定容至1L分装成小份并高压灭菌备用。【意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长期存放。19．β-巯基乙醇BME溶液【配制方法】

一般得到的是14.4mol/L溶液应在棕色瓶中保存于4。【注意】或含有BME的液不能高压处理。20．NBT溶液【制方法】

把0.5g氯氮蓝四唑溶解于10ml70%二甲基甲酰胺中，保存于4℃。21．酚/仿溶液【配制方法】

把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris·HCl(pH7.6)抽几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/lTris·HCl(pH7.6)层，保存于℃。【意】

酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风橱中进行。与酚接触过的部位皮肤应用大量的水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。

22．10mmol/L苯基磺酰氟（PMSF溶液【配制方法】

用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L）分装成小份贮存20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液100mmol/L。【意】PMSF严损害呼吸道粘膜眼及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险旦眼睛或皮肤接触了PMSF应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污的衣物应予丢弃PMSF水溶液中不稳定应使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中PMSF在水液中的活性丧失速率随pH值的高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。值为8.0时20μmmol/lPMSF溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为性pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。23．酸盐缓冲溶液（PBS）溶【制方法】

在蒸水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl节溶液的pH值至加定容至1L，15lbf/in2(1034×105Pa)压下蒸气灭菌20min保存于室温。．乙酸钾（pH7.5）液【制法】

将9.82g乙钾溶解于90ml纯中，用2mol/L乙酸调节pH值7.5后入纯水定容到1L，保存-20。．酸钾溶液（用于碱裂解）【配制方法】

在60ml5mol/L乙钾溶液中加11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而酸根浓度为5mol/L的溶液。263mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）液【制方法

在80ml水溶解408.1g三乙钠，用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH值至7.0定到1L后高压灭菌。27NaCl溶【制方法】

在800ml水溶解NaCl水定容至1L分装后高压灭菌。28．10%十二烷基酸钠（SDS）液【制方法】

在900ml水溶解100g电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节溶的pH值7.2，加水定容至1L，分装备用。【意的微细晶粒易扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS10%SDS溶无须灭菌。29溶液【制方法】

在800ml水溶解175.3gNaCl和88.2g檬酸钠，加入数滴10mol/l溶调节pH值至加水定容至1L分装后高压灭菌。．20×SSPE溶液【制方法】

在800ml水溶解17.5gNaClNaH2PO4·H2O7.4gEDTA，用NaOH溶液调节pH值7.4（需6.5ml10ml/LNaOH，加水定容至1L，分装后高压灭菌。31100%三乙酸溶【制方法】

在装有TCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100%（）TCA321mol/LTris溶液【制方法】

在800ml水溶解121.91g碱，加入浓HCl调pH值至需值。pHHCl7.470ml7.660ml8.042ml

应使溶液冷至室温后方可最后调定值，水定容至1L，分装后高压灭菌。【注意】

如溶呈现黄色，应予丢弃并置备质量更好的Tris

尽管多种类型的电极均不能准确测量Tris液的pH值，但仍可向大多数厂商购合适的电极。Tris溶的pH值温度而异，温度每升高1℃，值大约降低个单位。例如0.05mol/L的液在5℃、25℃、和37℃的值分为9.5和。33缓冲盐溶TBSTris）【配制方法】

在800ml蒸馏中溶解8gNaCl0.2gKCl和3g碱，加入0.015g酚

用HCl调至pH值7.4，用蒸水定容至，分装后在151bf/in2(1.034×105Pa)高下蒸汽灭菌20min，室温保存。34X-gal溶【配制方法】X-gal为5-溴4-氯3-吲哚β-D半糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配成的20mg/ml的存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无过滤除菌。试剂Denhardt试剂

杂交试验中用于降低背景的封闭剂用途Northern杂使用RNA探的杂交单拷贝序列的Southern杂交将DNA固于尼龙膜上的杂交Denhardt试通常配制50×贮液，过滤后保存20℃。可将该贮存液10倍稀于预杂交液（常为含有0.5%SDS和100μ经变性被打断的鲑精DNA的6×SSC6×SSPE）中。50×Denhardt液含5g聚蔗Ficoll,400型Pharmacia）5g聚烯吡咯烷酮和5g牛清白蛋白（组分V”Sigmal），加水至终体积为500