茶叶有效成分分离技术-茶叶复合多糖的提取纯化（茶叶深加工）

茶叶有效成分分离制备技术茶叶复合多糖的提取纯化茶叶复合多糖的提取纯化茶多糖（TPS）是茶叶中的一种生理活性物质，是与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白的总称。由于茶叶中多糖与蛋白质、脂类呈复合状态，故而提取的多糖一般为复合多糖。采用不同的提取方法，得到茶多糖含量差异很大。产品若属脂多糖，为类脂与糖的复合物，精制时需脱脂处理；若属蛋白多糖，即为蛋白质与多糖的复合物，精制时需脱蛋白。根据多糖的含量水平，可分为粗品（10%〜20%）、中档品（20%〜50%）和精品（50%以上）。茶叶复合多糖可进一步纯化，但纯化步骤越多，得率越低，仅为0.1%〜0.5%。目录壹贰茶叶复合多糖的提取叁茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色茶叶复合多糖的分离纯化壹茶叶复合多糖的提取一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程1.单一提取工艺流程超滤醇沉淀一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程1.单一提取工艺流程乙醇提取CTAB（十六烷基三甲基漠化钱）沉淀一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程

CTAB沉淀法制备的茶多糖粗提物中，蛋白质含量达2.81%,即CTAB沉淀多糖的同时，把蛋白质也一起沉淀下来；醇沉淀法提取的茶多糖的多酚含量最高；与CTAB沉淀法和醇沉淀法相比，超滤法所得的粗茶多糖的多糖含量高，多酚、可溶性蛋白质含量均较低。有关研究通过纸层析和气相色谱分析，3种工艺所提取的茶多糖均由阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、半乳糖及半乳糖醛酸组成，组成比差异不大。1.单一提取工艺流程一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程2.综合提取工艺流程综合提取工艺流程茶叶原料预处理主要是釆用植物粉碎机粉碎，以利于浸出。浸提一般依提取目的不同，方法亦不一样，如需脱脂，最好先行用乙醇脱脂，然后用水（冷或热水）、稀酸、稀碱或稀盐溶液进行提取。如用稀酸提取，时间宜短，温度最好不超过5°C；用稀碱提取，为防止降解，常要在Ｎ2气流下进行。根据实验，用热水浸提得率高于用冷水浸提，且不需要迅速中和与透析，因此在生产中可选用热水浸提较好。一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程2.综合提取工艺流程该方法是先将水浸出物中的咖啡碱和茶多酚等分离出来，再用乙醇沉淀茶多糖。1.沸水浸提法提取工艺流程如下：一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程2.综合提取工艺流程该方法是先行用乙醇脱脂，然后用水（冷或热水）、稀酸、稀碱或稀盐溶液进行提取。如用稀酸提取，时间宜短，温度最好不超过5°C；用稀碱提取，为防止降解，常要在Ｎ2气流下进行。２.乙醇脱脂法提取工艺流程如下：一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程沉淀是利用茶叶复合多糖不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂特点采用乙醇、甲醇或丙酮等沉淀析出。值得注意的是，因茶叶浸出液中常有丰富的其他成分，因此选用沉淀试剂不同，不仅茶叶复合多糖得率不同，而且组成成分亦不同。岑夫釆用冷水浸提，然后在碱性条件下用乙醍、乙酸乙酯和丁醇依次萃取去除脂类、茶多酚等，然后透析，过葡聚糖凝胶柱，测得该多糖复合物的相对分子质量为4X104，其组成成分为葡萄糖、阿拉伯糖和核糖。也有人以乌龙茶为原料用热水浸提，乙醍、丙酮、无水乙醇洗脱，然后用Sevag法除蛋白，并用蒸儒水透析。最后过SaphdexG-200柱，测得多糖复合物相对分子质量为11X104。用气相色谱测定得知多糖复合物的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖和半乳糖，组成比例为5.52：2.21:6.08:44.20:41.99。一般来说，如果提取的茶叶复合多糖是制备丸片、胶囊的原料，此时所提取的多糖可不必除蛋白、脱色，仅用粗制品即可。但如果是制备茶多糖的饮料或针剂，则必须对茶叶复合多糖进行分离纯化。一、茶叶复合多糖的提取（一）工艺流程制法提要类脂总糖总氮总磷蛋白质热酚法，未经沉淀21.525.60.910.535.69水提法，乙醇沉淀52.043.10.811.255.06水提法，乙醇沉淀57.926.00.490.763.06热酚法，离心代替过滤37.234.50.700.714.38粗制品，未经酚处理，透析9.511.811.290.9470.56热酚法，丙酮沉淀58.532.80.721.234.50酸性乙醇提取，丙酮沉淀36.547.71.021.236.38表3-3不同制备方法与茶叶复合多糖的组成成分（%）（严鸿德等，1998）一、茶叶复合多糖的提取（二）辅助提取技术茶多糖易溶于水，可用沸水将茶多糖从茶叶中提取出来。研究表明，总糖含量：酸性乙醇提取法（47.7%）＞水提法（43.1%）＞热酚法（8%），前两者相差4.6%，从生产成本的角度和安全性考虑，宜采用水提法。此外，茶多糖可以用纤维素酶、超声波、微波等辅助法提取。贰茶叶复合多糖的脱蛋白和脱色二、茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色（一）脱蛋白粗多糖中含有大量蛋白质等杂质，不仅会使茶饮料因美拉德反应而使饮料色变，而且往往有沉淀物产生，故需除去蛋白质。常用的脱蛋白方法有以下几种。先将多糖水溶，再用氯仿、丁醇按5:1或氯仿、戊醇按4：1比例混合后，加至处理样中振摇，处理样中的蛋白质与混合液就形成了凝胶。凝胶可待完全分层后分离，亦可用离心法除去。除蛋白质后还须透析，以除有机试剂或小分子的成分。透析是用半透性膜先在自来水下透析Id，然后再在蒸馋水下透析12h即可。该方法是经典的脱蛋白方法，其优点是操作条件温和，可避免多糖降解。缺点是一次只能脱去少量蛋白，即使重复多次，也难将蛋白除尽。倪德江研究比较发现，前三次共脱去绿茶多糖中总蛋白的40%，而只脱去乌龙茶多糖中总蛋白的21%。1Sevag法二、茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色（一）脱蛋白汪东风等认为，茶多糖是一类与蛋白相结合的糖复合物，不能用蛋白酶去除茶多糖中的杂蛋白，然而Sevag法又难将茶多糖中的游离杂蛋白除尽，因此在样品纯度要求高、原料来源广泛的情况下，可适当采用脱蛋白效果更好的三氯乙酸法。2三氯乙酸法该方法提取效率高，但三氟三氯乙烷易挥发，不宜大量应用。３三氟三氯乙烷法二、茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色（二）脱色众所周知，茶叶富含茶多酚，而茶多酚在空气中极易氧化而色变。因此在提取茶叶复合多糖时往往有极少量的茶多酚，从而造成提取时茶叶复合多糖水溶液呈浅黄色，干燥时颜色加深。颜色加深影响了它在食品饮料等方面的应用，故需脱色。茶多糖的色泽也是影响茶多糖分离纯化、化学结构、作用机理及构效关系研究的一个瓶颈。因此，对粗茶多糖进行脱色。二、茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色（二）脱色兼有脱色分离的作用，常用的离子交换树脂有DEAE纤维素和Sepharose系列。1.离子交换法采用金属铁、铜和铅等沉淀茶多糖，从而使茶多糖和部分色素相分离。２.金属络合法物理吸附法常用聚酰胺大孔吸附树脂、活性炭、硅藻土、高岭土和PVPP等作为吸附剂。3.物理吸附法二、茶叶复合多糖的脱蛋白与脱色（二）脱色采用H2O2，虽有一定的脱色作用，但对茶多糖有降解作用。该方法具体步骤:将茶叶复合多糖水溶，用氨水调pH至8，在50℃以下滴加20%H2O2。至溶液为淡黄色，保温2h，对流水及蒸馏水透析，浓缩后用乙醇重新醇析即可。4.氧化法在以上方法中，以离子交换树脂法和聚酰胺大孔吸附树脂法应用较多。叁茶叶复合多糖的分离纯化三、茶叶复合多糖的分离纯化目前可用于茶叶复合多糖分离纯化的方法较多，如活性炭柱分离、超滤法分离和凝胶层析分离等。这些方法各有优点，使用时可用一种方法达到分离纯化的目的，也可用2〜3种按不同的先后进行分离纯化。现分别介绍它们的各自特点。三、茶叶复合多糖的分离纯化（一）活性炭柱分离活性炭柱分离的优点主要是分离容量大、适用范围广、无机离子干扰小等。其过程如下：洗洁玻璃柱，下衬填玻璃棉，然后将等质量的粉状活性炭和硅藻土在烧杯中混匀后，均匀装入柱中，装毕在炭面上覆盖一层玻璃棉。（1）装柱（2）活化用浓盐酸(AR)慢慢淋洗使活性炭活化，然后用蒸徳水淋至中性。如是湿法装柱，应先将活性炭用20%盐酸或醋酸煮沸0.5h，达到活化的目的。三、茶叶复合多糖的分离纯化（一）活性炭柱分离一般是将糖样的水溶液缓缓加入柱内，若样品溶液体积较大，可待液面接近炭面时再分次加入。（3）进样待样品溶液的液面接近炭面时，用60%乙醇溶液洗脱，分部收集，蔥酮检测。将含同一组分的洗脱液在旋转薄膜蒸发器上除去溶剂(40°C左右)，再醇析干燥，最后可得到较为纯净的茶叶复合多糖。（4）洗脱三、茶叶复合多糖的分离纯化（二）超滤法分离超滤法分离的主要优点是操作条件温和，不会引起多糖的降解，设备简单，操作方便，不经任何化学物质处理等。其过程如下：首先要依据茶叶复合多糖的特点选择适当的超滤系统及膜组合。茶叶复合多糖粗制品有较强生理活性部分，其相对分子质量在4X104。〜1X105。因此选定了超滤器后，在膜孔径选择上可选用相对分子质量1X105以上不通过和相对分子质量4X104以下可通过等膜系统。其次是调试和预试验。这主要是确定适宜的压力和温度。压力过大开始流速快，但很快就会在膜表面形成“浓差极化”现象，造成通量变小，欲速则不达。最好在45〜50°C下进行，在此温度下既不会引起茶叶复合多糖变性，又能降低黏度增加通量。最后就是按选定的压力和温度进行超滤。一般在超滤前最好选用孔径为1um的滤棒进行预过滤，以滤除多糖溶液中存在的大颗粒。三、茶叶复合多糖的分离纯化（三）凝胶层析分离凝胶层析分离又称凝胶过滤、分子筛过滤等。凝胶层析分离的特点：技术操作简便易行，操作条件温和，工作范围广，分离效果好，重复性高，层析床可反复使用等。它是目前多糖分离纯化的最重要手段。凝胶层析分离的过程如下：在茶叶复合多糖分离时多选用SephadexG50-200型，工作范围为相对分子质量5X102〜2X105。因此，完全能满足茶叶复合多糖分离纯化的需要。一般先用SephadexG50以分离相对分子质量在1X104以下的各组分。然后选用SephadexG150〜200，以达到进一步纯化的需要。凝胶选择好后，可将凝胶放入0.1mol/LNaCl洗脱液中充分溶胀1〜2d。（1）凝胶选择及准备三、茶叶复合多糖的分离纯化（三）凝胶层析分离装柱是凝胶层析中极为关键的一个步骤，同时又是一个实验性很强的工作，因此一定要注意避免层析柱有“纹路”和柱壁与柱中不均匀现象。（2）装柱将茶多糖溶于水中，浓度在3〜4mg/mL，用0.1mol/LNaCl洗脱液按10mL/min流速洗脱，分部收集，蔥酮法检测，收集单一组分洗脱液，在旋转蒸发器上减压浓缩，最后醇析干燥即可。（3）上样和洗脱三、茶叶复合多糖的分离纯化（三）凝胶层析分离值得注意的是，对于茶叶复合多糖的纯化，其纯度是相对的，不可能像某些成分那么单纯。在这里所提的纯化仅是指通过上述措施可得到相对分子质量在某一较小范围里较为均一的多糖。如果不是为了研究茶叶复合多糖的结构、组成等需要，可不必如此反复纯化。因为茶叶经几千年饮用及现代医学验证不含有害成分，茶叶复合多糖中混杂有少量其他成分，不影响它的作用效果。三、茶叶复合多糖的分离纯化（四）沉淀法分级分离沉淀法分级分离不同性质以及不同分子质量段的多糖在不同浓度乙醇中的溶解度是有差别的，利用这一差别，可以分离沉淀到某一性质或某一分子质量段占主要部分的茶多糖，如图3-3所示。按上述方法从提取了茶多酚的茶叶废渣中分离纯化出灰色茶叶多糖TPS-3。

TPS-1、TPS-2及TPS-3依次为2.8%、0.7%及3.8%。（1）产品得率以蔥酮-硫酸法测定多糖总糖含量，TPS-1.TPS-2及TPS-3分别为48.24%、57.71%及40.02%。（2）产品纯度三、茶叶复合多糖的分离纯化（四）沉淀法分级分离TPS-1为L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖及D-果糖(比例为3.51：14.78：20.46：61.25)；TPS-2为D-木糖、L-阿拉伯糖、D-果糖(比例为4.39：16.22：79.