微生物工业的菌种

微生物工业的菌种第1页/共69页

在微生物工业中，起决定作用的是微生物的菌种，要获得一个具有潜在工业应用价值的微生物菌种的第一步是必须从自然界中分离出这种微生物。第2页/共69页一、生产菌种的分离、筛选（一）材料的选择（二）材料的预处理（三）分离、筛选方案的设计（四）菌种的培养和选择第3页/共69页（一）材料的选择土壤水域(海洋、湖泊、河流)生物体内极端环境和特殊的生态环境第4页/共69页（二）材料的预处理热处理法膜过滤法化学药品处理第5页/共69页

用0.01N的NaOH处理样品，可分离得到小单孢菌。用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。第6页/共69页（三）分离、筛选方案的设计筛选模型加选择性压力富集培养、诱饵法反应特性随机分离第7页/共69页在抗生素的筛选过程中，为避免致病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌而又能代表致病菌的其它微生物作为试验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛选模型。筛选模型第8页/共69页小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum

稻瘟菌Piriculariaoryzae

油菜菌核Sclerotiniasclerotiorum

王静，杨澄然等

第9页/共69页加选择性压力加入不同的抗生素或试剂来增加选择性，如分离真菌时，可加入抗细菌抗生素，分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素。第10页/共69页富集培养指能增加混合菌群中所需菌株的一种技术，方法是在混合菌群中提供有利于所需菌株生长或不利于其它微生物生长的条件。例分离趋磁细菌通常先富集方法样品中加入有机酸，矿质元素，铁等在25-30℃条件下富集1月左右。第11页/共69页诱饵法在分离样品或培养基中加入一些特殊的营养物，待菌生长一定时间后，再进行分离。如将涂石蜡的棒置于培养基中，可分离到诺卡氏菌。以纤维素作为唯一碳源培养基可分离到分解纤维素的菌群。第12页/共69页反应特性如分离蛋白酶，在不溶性蛋白的平板上可产生一清晰的透明圈，透明圈的大小可作为选择的依据。第13页/共69页随机分离制备一系列培养基，其中各种类型的养分成为限制因子。避免使用容易同化的碳、氮源，因为它们可能产生分解代谢物阻遏。第14页/共69页（四）菌种的培养和选择温度：放线菌：25～30℃嗜热菌：45～55℃嗜冷菌：4～10℃时间：延长培养时间可以分离到新的或不寻常的菌株第15页/共69页大量选择选择某一类（种或属）第16页/共69页菌种筛选时应考虑的一些重要指标1、菌的营养特性2、菌的生长温度3、菌对生产设备和生产过程的适应性4、菌种的稳定性5、从发酵液中提取产物的情况

6、产物的收得率情况第17页/共69页(一)自然选育(二)常规诱变育种(三)合理诱变育种(四)原生质体融合技术(五)基因工程技术二、高产菌株的选育第18页/共69页(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：（通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径）。(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。工业菌种改良方法第19页/共69页

从自然界直接分离得到的菌种，一般不会立即适合实际生产的需要，只有通过选育，才能提高产物的产量，改进品质，甚至简化工艺。第20页/共69页(一)自然选育

不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。第21页/共69页(二)常规诱变育种

利用物理、化学等诱变剂，使微生物发生突变而进行菌种选育的过程。

第22页/共69页常规诱变育种的一般操作过程出发菌种原种特性考察斜面或摇瓶培养孢子液细胞液诱变剂处理第23页/共69页稀释平板分离

以未处理的菌种液为对照，计算致死率；观察单菌落形态，统计形态变异率。选择、挑取单菌落，转管保存初筛（以出发菌种为对照）选出高产突变株，并留种保存第24页/共69页复筛（以出发菌种为对照）根据情况进行第二、第三……复筛选出高产突变株，并留种保存选出高产突变株，并留种保存第25页/共69页高产菌株的稳定性试验菌种特性考察小发酵罐试验放大试验、中试考查高产菌种培养条件的优化试验第26页/共69页大罐试验生产第27页/共69页诱变育种应注意的几个问题(1)出发菌株的选择(2)复合诱变剂的使用(3)诱变剂的剂量(4)突变株的筛选(5)高产突变株培养条件的优化第28页/共69页常用物理、化学诱变剂：(1)紫外线(2)快中子(3)高频电子流(4)Co-60(5)亚硝酸

(6)氮芥(7)亚硝基胍第29页/共69页（三）合理诱变育种根据微生物的代谢调节机理来选择一定类型的微生物突变株，以获得高产菌株。代谢过程是由酶催化完成的，因此代谢途径的调节也就是酶的调节。酶合成的调节酶的调节酶活性的调节第30页/共69页酶合成的调节：诱导：只有在有诱导物存在的时候，酶才能合成，这样的酶称为诱导酶。不需诱导物就能合成的酶是组成酶。诱导又分为协同诱导、顺序诱导等。阻遏:是阻止酶的合成，又有反馈阻遏、分解代谢物阻遏等。第31页/共69页酶活性的调节：对已经存在酶的活性进行调节，分为激活和抑制。酶的激活有前体激活、补偿性激活等；酶的抑制有终点产物反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制等。第32页/共69页(1)选育组成型菌株(2)选育抗反馈调节的突变株(3)选育营养缺陷型(4)选育负变菌株的回复突变株(5)选育条件抗性突变株(6)选育细胞膜透性改变的突变株(7)选育抗生素抗性突变株第33页/共69页(四)原生质体融合技术也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质(包括核DNA和核外基因)进入另一个细胞。它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下去。第34页/共69页原生质体再生原生质体化原生质体融合原生质体融合简要说明第35页/共69页金色链霉菌，四环素发酵单位14000~17000g/ml淡红链霉菌(正定变种1482)，柔红霉素发酵单位60~80g/ml原生质体原生质体原生质体融合再生、筛选得到PF-25菌株，柔红霉素发酵单位250~300g/ml第36页/共69页阿克拉霉素产生菌(链霉菌)诱变突变株A不合成阿克拉霉素，但合成阿克拉霉素前体的类似物和2-hydroxyaklacinoe突变株B不合成阿克拉霉素，也不合成阿克拉霉素前体的类似物，但能在2-hydroxyaklacinoe上接上糖苷原生质体融合融合子产生2－羟基阿克拉霉素第37页/共69页用原生质体技术提高发酵单位的例子产物性质菌种增产效果西索米星硫链丝菌肽碳青霉烯麦迪霉素庆大霉素头霉素C巴龙霉素种内种内种内种内种间属间种内种内种间Micromonosporaingoensis运青链霉菌灰色链霉菌生米卡链霉菌生米卡链霉菌/灰色链霉菌小单孢菌/灰色链霉菌小单孢菌Nocardialactamdurans

链霉菌/弗氏链霉菌10～15％2倍10倍40％5倍58％52％15％5～6倍第38页/共69页原生质体融合技术的优点：(1)去除细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换和实现重组，不需要有已知的遗传操作系统(2)原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子(3)重组频率特别高(4)可以和其它育种方法相结合(5)可以用药物、温度、紫外线钝化亲株的一方，然后再进行融合，这样可以提高筛选的效率(6)原生质体融合并不局限于种内，还可以进行种间和属间的原生质体融合第39页/共69页(五)基因工程技术

无论用什么方式获得的DNA分子，插入到任何载体(包括病毒、细菌的质粒)，使之形成遗传物质的新组合(即重组DNA分子)，再将它们转移到一种原来并不含有这样新组合的宿主细胞中去，使宿主细胞获得新的遗传信息并稳定遗传下去，成为新型生物。第40页/共69页基因工程简要说明E.coli任意细胞提取质粒提取DNA限制性内切酶退火第41页/共69页

连接酶

转入

E.coli

繁殖、表达基因工程简要说明第42页/共69页第43页/共69页第44页/共69页第45页/共69页1、基因工程生产蛋白质及多肽类药物蛋白质及多肽药物的基因工程是生物工程中最活跃和最有成就的领域。目前应用基因工程方法生产的这类药物已投放市场的有胰岛素、干扰素、人生长激素、白介素2、促红细胞生长素、肿瘤坏死因子、人心钠素、表皮生长因子等。第46页/共69页

人胰岛素由A、B二条链组成，A是21个氨基酸，B链是30个氨基酸，由2个2S键相连。

合成胰岛素A链基因合成胰岛素B链基因插入pBR322质粒分别转入E.coli表达启动子-半乳糖苷酶启动子-半乳糖苷酶胰岛素A链基因胰岛素B链基因第47页/共69页

胰岛素A链

胰岛素B链

BrCN切割化学结合胰岛素

-半乳糖苷酶

-半乳糖苷酶第48页/共69页

提高特定基因的表达水平(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等。(2)诱导解除基因表达抑制的突变。第49页/共69页第50页/共69页2、以基因工程为手段改变代谢途径，改进生产工艺，提高发酵单位D-葡萄糖D-山梨醇D-山梨糖双丙酮-L-山梨糖双丙酮-2-酮基-L-古龙酸2-酮基-L-古龙酸L-抗坏血酸莱氏法Vc生产工艺加氢还原化学氧化酮化化学氧化烯醇化、内酯化第51页/共69页

D-葡萄糖

2.5-二酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-L-古龙酸

L-抗坏血酸欧文氏菌棒杆菌2.5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶基因工程欧文氏菌第52页/共69页3、基因工程在抗生素生产菌种改造方面的应用①解除限速步骤，提高抗生素产量在抗生素合成中，某些步骤对整个生物合成至关重要，对这些关键步骤酶(限速酶)的改造，可以提高抗生素的产量。如十一烷基灵红菌素和秦乐菌素生物合成的最后阶段的酶是限速酶，该过程是由一个甲基转移酶控制的，将该酶基因克隆后，经过适当改造，再转入原菌株阻断突变株中，使得该酶活性大幅度提高，最终使抗生素的合成能力提高了近10倍。第53页/共69页②阻断支路代谢，增加有效组份含量

阿维菌素B组分向A组分的转化是由aveD

基因编码的C5-O-甲基化酶催化的。AveD第54页/共69页③引入抗性基因或调节基因，提高抗生素产量大多数抗生素产生菌都具有对自身产生的抗生素的耐受能力，而抗生素的产量一定程度上取决于对自身产生的抗生素的耐受能力的大小，利用多烤贝质粒，克隆这些抗性基因，再转入到产生菌中，从而提高抗生素产生能力。如克隆氨基糖苷δ’-乙酰转移酶基因，再转入卡那霉素和新霉素产生菌中，结果使菌种自身对氨基糖苷类抗生素的抗性增加，使卡那霉素和新霉素的产量提高了2～6倍。第55页/共69页④引入血红蛋白基因，提高抗生素产量在抗生素发酵过程中，供氧往往是一个限制因素，且大量消耗能源。在解决供氧方面也有不少成功的报道，美国科学家将与氧传递有关的透明颤菌的血红蛋白基因，克隆到天蓝色链霉菌中，可使在通气不足时放线紫红素的产量提高4倍。将血红蛋白基因克隆到头孢菌素C产生菌后，该菌在发酵过程中氧耗明显下降，且有效增加了头孢菌素C的产量。第56页/共69页DrLiuJiangningetalAppliedMicrobiologyandBiotechnology,2008,DOI10.1007/s00253-008-1665-158.4±6.4mg/lDisruptionforphbcgenes第57页/共69页(一)退化的原因(二)防止退化的措施三、菌种退化第58页/共69页菌种退化：菌种的一个或多个特性，随时间的推移逐步减退或消失的现象，一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物、产量的下降。第59页/共69页(一)退化的原因1、菌系不纯2、异核现象3、自然分化现象4、回复突变5、培养条件或保藏方法问题6、其它第60页/共69页(二)防止退化的措施1、多做平行菌种，少转接传代2、认真进行单菌落分离3、选择有利于高产菌，不利于低产菌的培养条件4、良好的保藏方法第61页/共69页四、菌种保藏(一)菌种保藏的原理(二)常用菌种保藏方法(三)国内外重要的菌种保藏机构第62页/共69页(一)菌种保藏的原理1、控制营养2、缺氧3、干燥4、低温第63页/共69页(二)常用菌种保藏方法1、斜面冰箱保藏法2、砂土管保藏法3、覆盖惰性液体保藏法4、真空冷冻干燥保藏法5、－30℃、—70℃低温保藏法6、液氮超低温保藏法第64页/共69页(三)国内外重要菌种保藏机构

1、ATCC：美国模式培养物(菌)保藏中心2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部3、CSH：美国冷泉港研究所4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所