沉淀蛋白质常用方法

积淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮积淀蛋白操作步骤）TCA-DOCForprecipitationofverylowproteinconcentration1)Toonevolumeofproteinsolution,add1/100vol.of2%DOC(Nadeoxycholate,detergent).2)Vortexandletsitfor30minat4oC.3)Add1/10ofTrichloroaceticacid(TCA)100%vortexandletsitONat4oC(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleatcareful,usegloves!!!).4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).[OPTION:Washpellettwicewithonevolumeofcoldacetone(acetonekeepat20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeedbetweenwashes].5)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryair.ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)NormalTCAToeliminateTCAsolubleinterferencesandproteinconcentration1)ToasampleofproteinsolutionaddTrichloroaceticacid(TCA)100%toget13%finalconcentration.Mixandkeep5min20oCandthen15min4oC;orlongertimeat4oCwithoutthe20oCstepforlowerproteinconcentration.Suggestion:leaveONiftheproteinconcentrationisverylow.(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleatcareful,usegloves!!!).2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).3)ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)AcetonePrecipitationToeliminateacetonesolubleinterferencesandproteinconcentration1)Addto1volumeofproteinsolution4volumesofcoldacetone.Mixandkeepatleast20min20oC.(Suggestion:leaveONiftheproteinconcentrationisverylow).2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).3)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.EthanolPrecipitationUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforeSDS1)Addto1volumeofproteinsolution9volumesofcoldEthanol100%.Mixandkeepatleast20oC.(Suggestion:leaveON).2)Spin15min4oCinmicrocentrifugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).3)Washpelletwith90%coldethanol(keepat20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeed.4)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryairtoeliminateanyethanolresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.TCA-DOC/AcetoneUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremoveacetoneandTCAsolubleinterferences1.Toonevolumeofproteinsolutionadd2%Nadeoxycholate(DOC)to%final(for100μlsample,add1μl2%DOC).2.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast15min.3.100%trichloroaceticacid(TCA)toget10%finalconcentration(preparationof100%TCA:454mlH2O/kgTCA.Maintainindarkbottleatcareful,usegloves!!!).4.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast1hour.5.Spinat4oCfor10min,removesupernatantandretainthepellet.Drytubebyinversionontissuepaper.6.Add200μloficecoldacetonetoTCApellet.7.Mixandkeeponiceforatleast15min.8.Spinat4oCfor10mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.9.Removesupernatantasbefore(5),dryairpellettoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForSDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.10.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)AcidifiedAcetone/MethanolUsefulmethodtoremoveacetoneandmethanolsolubleinterferenceslikeSDSbeforeIEF1)Prepareacidifiedacetone:120mlacetone+10μlHCl(1mMfinalconcentration).2)Prepareprecipitationreagent:Mixequalvolumesofacidifiedacetoneandmethanolandkeepat-20oC.3)Toonevolumeofproteinsolutionadd4volumesofcoldprecipitationreagent.MixandkeepONat-20oC.4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).5)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneormethanolresidue(smelltubes).TCA-EthanolPrecipitationUsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforeSDS1)Dilute10-25μlsamplesto100μlwith2OAdd100μlof20%trichloroaceticacid(TCA)andmix(preparationof100%TCA:454ml2O/kgTCA.Maintainindarkbottleatcareful,usegloves!!!).2)Leaveinicefor20min.Spinat4oCfor15mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.3)Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:drytubebyinversionontissue(pelletmaybedifficulttosee).4)Washpelletwith100-cdryandresuspendinsamplebuffer.5)IncasetherearetracesofGuHClpresent,samplesshouldbeloadedimmediatelyafterboilingfor7minat95C°6)(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit-PIERCEThePAGEprepKitenablesremovalofmanychemicalsthatinterferewithSDSanalysis:guanidine,ammoniumsulfate,othercommonsalts,acidsandbases,detergents,dyes,DNA,RNA,andlipids.PIERCE:#26800preTMpProteinClean-upandEnrichmentKit(pdf)ChloroformMethanolPrecipitationUsefulmethodforRemovalofsaltanddetergents1)Tosampleofstartingvolume100ul2)Add400ulmethanol3)Vortexwell4)Add100ulchloroform5)Vortex6)Add300ulH2O7)Vortex8)Spin1minute@14,0000g9)Removetopaqueouslayer(proteinisbetweenlayers)10)Add400ulmethanol11)Vortex12)Spin2minutes@14,000g13)RemoveasmuchMeOHaspossiblewithoutdisturbingpellet14)Speed-Vactodryness15)Bringupin2XsamplebufferforPAGEReference:Wessel,D.andFlugge,U.I.Anal.Biochem.(1984)138,141-143蛋白质浓缩1130徐炉李2011-05-2814:35楼主蛋白质浓缩——方法很全-论坛-医学/药学/生命科学论坛蛋白质浓缩方法总结一个简易的方法你能够试一试：找一透析袋，底部扎紧，袋口扎一去底的塑料或玻璃试管，将待浓缩的液体从管口灌入透析袋中，将整个装置挂在冰箱中，或许用电电扇吹，液体干后可再持续加入，直至样品浓缩至所需体积。如必需，可预先将待浓缩液用蒸馏水或去离子水透析以去盐分，而后再按上述方法浓缩，这样能够防止浓缩后盐份过高。此法简易易行，我们实验室常用此法浓缩。浓缩后的液体能够用吸管从试管口吸出，并且透析袋只需不破碎，可以频频使用。能够用millipore企业的amiconultra－15cenfilterunitetrifugalunits。每个30多元，但是效果特别好。只需要将培育上清加入，而后高速离心后即可直接获得无菌的浓缩液。对于新的透析袋有化学杂质，需要办理，为了去除这些杂质，往常我们用10mmol/L的碳酸氢钠，1mmol/L的EDTA溶液煮沸30min，以后用双蒸水充分冲刷，以后放在EDTA溶液4度保留！防备微生物污染！！冷冻干燥或peg20000都能够此种方法就是超滤浓缩，使用方式有的是离心，有的是加压，有的两者皆用。除了amicon以外，我知道赛多利斯也是很出名的供给厂家，就是做天平很出名的那家德国企业。超滤浓缩这类方式确实太方便了，并且除了有浓缩作用外，还有脱盐功能，速度又快，比传统的透析好多了，实验室用和生产用型号都能找到。可是据介绍，不可以频频用！并且价钱大家也知道了，30元左右，一般一个包装25个，100个，单个还不知道卖不卖。依据中国国情，呵呵，我建议没经费的实验室仍是不要考虑啦；假如时间不紧张，不怕花几日时间，用25元/米的透析袋相同能够达到成效。冷冻干燥的体积自然越小越好了，假如你的蛋白很稳固那-70度应当没有什么问题的，我觉得冷冻干燥时间长，假如量不大直接用积淀的方法浓缩就能够了。浓缩的目的是使体积小这样快，而体积很大的话冷冻干燥慢，假如你的冷冻干燥机的真空、泵很好，那么体积大也没相关系，但是要保证你的液体的高度别超出2cm那其实也是很快的，因此重点看你样品的体积和你机器的利害了。能够试试看下边这个简单的方法：直接向要浓缩的蛋白质样品中加入sephadexG25干粉，待干粉吸水后离心取上清即可，这样离子强度保持不变，又达到了浓缩的目的我是用双蒸水进行除盐的，就是在刚开始的时候要多换几次双蒸水24小时就能够了。楼上占战友们所说的millipore的超滤离心管我原来想买的，但考虑到价钱的问题就放弃了。将样品放在透析袋中，注意留出一半的容积，（免得水将透析袋涨破）24小时后将透析袋放入的分子量为10000的聚乙二醇中，一般几个小时就能够了。我买的是入口分装的PEG，感觉不错。希望能对你有所帮助。三氯乙酸积淀可能会使蛋白变性的，那么再用PBS或其余缓冲液都难溶解要想保持蛋白的活性仍是别用这样的方法。电泳样品自然能够，但是要注意你的样品用缓冲液难溶解，能够直接加电泳上样缓冲液就能够了，没有必需再用PBS溶解。三氯乙酸积淀后，样品要用丙酮洗，而后要吹干，而后能够从头溶解般能够将样品放入透析袋，再将四周撒多点PEG20000，半天能够浓缩10倍以上假如打算用PEG的话，要选择好PEG的型号，某型号透析袋透过分子量的大小，还好考虑你的目的蛋白分子量的大小。我用过PEG2000，回收很方便。它的熔点很低，大概只有50度。就此刻的天气，把它平铺在磁盘里，自然干燥就行了。不建议大家采纳太小分子量的Peg，要依据透析带来选择，我一般是采纳透析膜能经过分子量的两倍以上的Peg，假如大家只用来做Western，用蔗糖就行了。我们在做sds的时候1M的三氯乙酸，把三氯乙酸除掉，假如三氯乙酸没有除洁净的话，样品加了LOADINGBUFFER此后会变为黄一些小分子的物质。2）有的样品办理过程相同，但宽窄不一，原由可能是样品中的盐浓度不一致，盐浓度过高会显着影响蛋白质的电泳，使蛋白质条带显然变宽，有时还会成浅笑状。我的经验与老兄不一样:1.胶中蛋白条带宽窄不一原由是:由于蛋白联合电荷量不一样!即所加样品中蛋白含量不一样!2.盐浓度过高不会显着影响蛋白质的电泳我用硫酸铵分级积淀时蛋白未透析.sds蛋白条带没有变化!你可做个比较看一下!取待浓缩样品，加入100uL三氯醋酸，振荡混匀后于4oC静置30后离心（10000X10min),去除上清积淀中加入1mLacetone(-20oC预冷)，强烈振荡混匀后.10000rpmX5min,此步能够重复一次以保证三氯醋酸能够完整除掉，最后将管子在室温搁置30分钟干燥后溶解于缓冲液中电泳剖析。假如不是预冷的丙酮，能够在低温冰箱中静置10分钟即可。看到大家在论坛上常常议论这个问题，我也凑凑喧闹！对于TCA积淀蛋白作为SDS－PAGE上样的准备在本论坛的贴子好多，各种各种的protocols都有，可是总结来说都是含两个方面，一是TCA积淀，二是用丙酮洗去残留的TCA！或许是大家做上游做的多了乱了思路，我也提提我的见解，希望能理清思路！TCA积淀蛋白的方法据我所知，最早是lowry于1951年发布在上的一篇题为“PROTEINMEASUREMENTWITHTHEFOLINPHENOLREAGEN用过的，自然这篇文章也就是着名的lowry法定量蛋白的提出篇！随后在好多文件，包含当今新的办理蛋白的文件中也有采纳，可见这个方法怎样的被喜爱！详细操作方面，不论你用什么：1的体积比也好，仍是摩尔浓度（1MTCATCA的终浓度在5％－10W/V，大家能够看看：Weroutinelyprecipitatesampleswithtrichloroaceticacid(TCA)beforeSDS.Thisconcentratesthesamples,eliminatesagreatdealofbuffervariability,anddenaturesproteinasesandsubstratesinarapidstepthatdoesnotallowtimeforextensiveartifactualproteolysis.Typically,afinalconcentrationofTCAof5%(w/v)at4Cfor10minwillbeadequate.Theprecipitatedproteinsarerecoveredbybriefcentrifugation(10,000gfor1min,inabenchtopmicrocentrifuge),andtheTCAispouredaway.ResidualTCA,whichwouldotherwisechangethepHofthesamplebuffer,isremovedbyrepeatedgentlewashingwithacetoneordiethylether,andafterthreewashes,theproteinpelletisredissolvedinSDSsamplebuffer.下边的两篇文件可供参照：I.PolacheckandE.Cabib,Anal.Biochem.117,311(1981).2.ENRICOCABIBandITZHACKPOLACHECK,methodsinenzymology104，415－416丙酮干燥时间必定不可以太长，不然pellet很难溶的，这是我的经验我看最简单的是将低浓度蛋白装入适合透析袋用PEG6000-8000包埋，每10min换一次PEG6000-8000,浓缩至微量体积后再用适合缓冲液透析有可能进入的微量小分子PEG，速度很快，我用它作过病毒的浓缩丙酮积淀都说会丢掉蛋白质，但是还有这么多人用积淀法！1、究竟会丢掉多少蛋白质2、为何会丢掉3、尿素和其余裂解液的成分溶于丙酮吗假如随着积淀下来，会不会影响上样液中各种成分的浓度，从而影响聚焦4、丙酮风干不充分，会影响IEF聚焦吗5、一般你们积淀多久最少多久6、丙酮积淀真的能够去除离子吗我的标本相同积淀，为何有时电压上不去有时上的去1,必定会丢掉蛋白质,详细丢多少取决于样品的种类.2,有些蛋白质一经积淀以后难以再溶解.3,应当不会随着积淀下来起码绝大多数不会.4,一般5分钟风干足够了尽量充分.5,最少2小时以上以积淀完整减少丢掉的蛋白质。偶常用积淀留宿。６，可去除大多数别子，但还有一小部分会随着积淀。丙酮中能够加ＤＴＴ，也能够不加。建议仍是加对溶解性有利处.-20度积淀留宿没问题.我用丙酮积淀发酵液的蛋白质，发酵液含有磷酸盐缓存液，用丙酮积淀后盐含量很高。我做了一个比较试验，将丙酮直接加在必定浓度磷酸盐缓存液中，显然看到白色的积淀，我感觉丙酮的去盐不好。感谢你，我也是由于有些思疑这个才发帖子的。你都用盐溶液试过了，事实胜于雄辩，看来去盐最多不过一部分。依据你的提示，回头我试一试向裂解液中加丙酮，看看尿素等会不会积淀下来。此外，丙酮不是抢夺水分，蛋白才会积淀下来吗因此溶于水的成分必定会积淀下来。这是我的理论上的推断。（供大家议论丙酮积淀的原理）此外我还感觉，假如裂解液的成分随着积淀下来，会影响上样液中各种成分的浓度，从而影响聚焦。因此我感觉积淀应当考虑裂解液的成分和浓度。（个人看法，供大家议论）建议主任给上边看法的朋友加分。有盐的样品其适用丙酮淀必定盐也会积淀下来的，这取决于盐的浓度和蛋白的浓度，理论上蛋白的浓度越高积