临床微生物学检验-细菌检验的基本技术

2023/2/15临床微生物学检验LaboratoryScienceofClinicalMicrobiology临床微生物检验教研室

12023/2/15细菌检验的基本技术第一节细菌形态学检查第二节细菌的培养和分离技术22023/2/15微生物分离鉴定流程32023/2/15第一节细菌的形态学检查工具：显微镜显微镜检查的目的：1.镜检可以了解标本中有无细菌及大致的菌量2.根据细菌形态、排列和染色性有助于对标本中的病原菌进行初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义方法：包括不染色标本检查法和染色标本检查法42023/2/15常用的显微镜（1）普通光学显微镜（lightmicroscope）光源：自然光或灯光，波长0.4μm最大分辨率：0.2μm（2）暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）（3）相差显微镜（phasecontrastmicroscope）（4）荧光显微镜（fluorescencemicroscope）（5）电子显微镜（electronmicroscope）返回52023/2/15普通光学显微镜62023/2/15目的：主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的方法：悬滴法和压滴法

一、不染色标本直接镜检72023/2/15悬滴法检查细菌的动力82023/2/1592023/2/15不染色标本镜下结果观察：动力（+），动力（-）观察时注意：用普通光学显微镜高倍镜观察，调小显微镜的光栅。有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移。无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。102023/2/15

意义：有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定：如疑似霍乱患者“米泔水样”便中发现穿梭样运动细菌，可辅助诊断。

螺旋体辅助诊断112023/2/15（一）常用染料（色基+助色基）1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等，电离后带正电荷，常用于细菌染色（原因何在？）。2．酸性染料：有伊红、刚果红等，电离后带负电荷。3．复合染料（中性染料）：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等。

二、染色标本的显微镜检查122023/2/15（二）常用的染色方法：正染色法和负染色法作用：染色标本的检查，可观察细菌的染色性、形态、排列、大小、某些特殊结构等。染色的基本步骤：涂片、干燥、固定、染色。背景着色菌体着色132023/2/15细菌的涂片制作方法①

菌悬液直接涂布②先加NS至载玻片再加菌落（苔）涂开142023/2/15正染色法：革兰染色、抗酸染色、荧光染色等1．革兰染色（gramstain）152023/2/15革兰阳性球菌革兰阴性杆菌162023/2/15革兰阴性球杆菌17革兰染色原理细胞壁学说等电点学说化学学说2023/2/15182023/2/152．抗酸染色（acid-faststain）可将细菌分为两大类：

-抗酸性细菌

-非抗酸性细菌19抗酸染色原理分枝杆菌等细菌细胞壁含有分枝菌酸，不容易跟石炭酸复红等染料结合，但一旦这些染料跟分枝菌酸结合后便很牢固，不容易被脱去颜色。2023/2/15202023/2/15212023/2/15抗酸染色结果222023/2/153．荧光染色（1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。（2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。结核分枝杆菌金胺O染色片232023/2/154.特殊染色（1）鞭毛染色：可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。（2）异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色。（3）芽孢和荚膜染色242023/2/15负染色法：墨汁染色，一般用于新型隐球菌检查252023/2/15第二节细菌培养和分离技术主要内容：一、培养基培养基的概念、培养基的组成成分、培养基种类、和培养基的制备二、细菌的人工培养与分离无菌技术、细菌的接种与分离方法、细菌培养方法、细菌的生长现象、临床标本细菌培养时培养基的选择262023/2/15

培养基（culturemedium）概念：是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。

一、培养基272023/2/15(一)培养基的组成成分1．营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子等。蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、无机盐类、鸡蛋和动物血清、生长因子2．水和凝固物质

琼脂（凝点和熔点相距大）3．抑制剂和指示剂282023/2/15（二）培养基种类按用途分类：1．基础培养基（basedmedium）2．营养培养基（nutrientmedium）3．鉴别培养基（differentialmedium）4．选择培养基（selectivemedium）5．特殊培养基（specialmedium）292023/2/15（1）基础培养基(basedmedium)

含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。302023/2/15（2）营养培养基（nutrientmedium）最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等312023/2/15

（3）鉴别培养基（differentialmedium）在培养基中加入特定的底物和酸碱指示剂，观察细菌在生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应来鉴别细菌，如各种糖、苷、醇类发酵管等。

322023/2/15各种糖苷醇类发酵管常用指示剂：酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝底物：各种糖、苷、醇类、氨基酸等①溴甲酚紫：酸性碱性332023/2/15②溴麝香草酚蓝在酸碱环境中的颜色变化

酸性中间过渡碱性342023/2/15③酚红碱性酸性352023/2/15④甲基红：酸pH4.4红色碱pH6.2黄色⑤中性红：酸性pH＜6.8红色，碱性黄色⑥厌氧指示剂：

亚甲蓝和刃天青（无氧：都是无色，

有氧：亚甲蓝蓝色，刃天青红色）362023/2/15372023/2/15双糖铁(KIA)培养基斜面观察：乳糖底层观察：葡萄糖、硫化氢、产气⑦指示剂：多用酚红（酸：黄，碱：红）382023/2/15（4）选择培养基（selectivemedium）培养基中加入抑制剂，抑制标本中杂菌生长，选择性让目的菌生长。SS平板392023/2/15肠道强选择性培养基：SS琼脂底物：乳糖指示剂：中性红（酸性红色，碱性淡黄色）抑制剂：胆盐抑制革兰阳性菌生长；枸橼酸盐和煌绿对大肠埃希菌生长有一定抑制402023/2/15肠道弱选择性培养基：麦康凯琼脂底物：乳糖指示剂：中性红（酸性红色，碱性淡黄色）抑制剂：胆盐（抑制革兰阳性菌生长）大肠埃希菌（红色菌落）和福氏志贺菌（淡黄色菌落）在麦康凯（Mac)平板上412023/2/15（5）特殊培养基（specialmedium）疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基

L型培养基42培养基按性状分类

（琼脂含量不同）2023/2/15液体培养基半固体培养基固体培养基不含琼脂含0.3%--0.5%琼脂含1.5%--2.0%琼脂43（三）培养基的制备调配溶解校正pH：最适pH一般为7.2-7.6分装灭菌：最常用高压灭菌法质量检验：无菌试验和效果检查保存2023/2/1544二、细菌的人工培养（一）无菌技术概念：防止环境中的微生物污染待检物（标本），同时防止待检物中可能存在的病原微生物污染环境和实验室人员的系列规范化操作技术。2023/2/15452023/2/151．平板划线分离法2．斜面固体接种法3．液体接种法4．半固体穿刺接种法5．倾注平板法6．涂布接种法掌握上述分离接种方法和目的（二）细菌的接种与分离方法462023/2/15472023/2/15分区划线培养后结果482023/2/15492023/2/15菌悬液液体培养基转种方法502023/2/15液体接种法

（鉴定、增菌）琼脂斜面接种法（双糖铁培养基常用此法接种）半固体穿刺接种法（观察动力、保存菌种）512023/2/15半固体穿刺接种后动力（+）和动力（-）结果

阳性阴性空白对照522023/2/15涂布接种法（药敏试验、菌落计数）53倾注平板法

将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，倾入已溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。根据培养基内的菌落数和稀释倍数，即可计算出标本的细菌数。测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。2023/2/15542023/2/15

1．需氧培养法

2．二氧化碳培养法

5%--10%CO23．厌氧培养法4.微需氧培养法5%O210%CO285%N2

（三）细菌培养方法55（四）细菌的生长现象细菌在固体培养基上的生长现象菌落：单个细菌分裂繁殖而成的肉眼可见的细菌集落。图菌苔：多个菌落连接而成的细菌群落。图细菌在液体培养基中的生长现象图

浑浊生长、表面生长、沉淀生长细菌在半固体培养基中的生长现象2023/2/1556各种菌落2023/2/15572023/2/15菌苔58细菌生长现象观察表面superficialgrowth沉淀precipitategrowth对照contrast混浊turbidgrowth细菌在半固体中生现象2023/2/15592023/2/15根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。1.粪便或肛拭子标本：GN肉汤增菌，转种或直接接种SS和Mac平板或中国蓝平板，疑似霍乱接种碱性蛋白胨水。（五）培养基的选择602023/2/152.血液、骨髓和脑脊液标本：用血液增菌培养基(需氧、厌氧），再转种血平板或巧克力平板或厌氧平板。612023/2/153.痰标本：选择血平板、巧克力平板、Mac或中国蓝平板。4.尿液标本：选择血平板、麦康凯5.脓标本：选择血平板6.泌尿生殖道分泌物：血平板、巧克力平板7.其他标本