抗生素杂质研究与控制的基本思路与策略

抗生素杂质研究与控制—基本思路与策略1杂质

任何影响药物纯度的物质统称为杂质。

－原料药中不属于原料药的任何成分。

－制剂中不属于原料药或辅料的任何成分。无治疗作用、影响药物稳定性和疗效、甚至对人体健康有害…Fanconi征候群现象—差向四环素、脱水四环素以及脱水差向四环素

N-甲基硫四唑(MTT)—引起血液凝固疾病及戒酒硫样反应β-萘酚—肾粘膜的刺激性…有关物质—与药物具渊源关系的物质工艺杂质、降解物、辅料杂质…不确定性杂质—交叉污染、外源性污染物（如灰尘等）、非正常渠道加入的物质…--GMP控制2

抗生素杂质的一般特点化学合成有机化学反应原子间的作用（共价键生成和断裂）反应釜取代、加成、置换…“直接”控制温度、压力、时间…

精细、准确、直接生成物反应母液--工艺杂质、中间体、副产物…

微量、可追踪微生物发酵生化反应、酶化学反应生命过程（初级代谢、次级代谢）细菌体细胞生长、发育、代谢和繁殖“间接”调制营养、生长环境、培养时间…复杂、宏观且细微、间接生成物发酵液--杂质、组份、异构体…

复杂、微量、难控制来源复杂、难以预测—微生物发酵3—半合成抗生素起始物为微生物发酵产物—纯度低组份复杂活泼基团较多—羟基、氨基、醛基…保护脱保护不稳定结构单元—内酯环、内酰胺环…大多存在构型问题…多种副产物、降解物、组分…杂质谱分析较为复杂、难以预测和控制。4抗生素杂质的一般特点组成复杂、监控困难发酵母液—目标物浓度很低，而生产物料含量高且复杂菌体细胞培养基各种蛋白质胶状物色素高价金属离子其它代谢物同系物异构体…天然化合物—分子结构复杂，平面结构、立体构型不稳定降解聚合…5抗生素杂质的一般特点活性（毒性）高、须严格控制发酵产物共性杂质—残存蛋白、色素、高价金属离子…过敏性、抗原活性高毒性金属杂质的分类控制…特定杂质—同系物、异构体以及半合成副产物…类似主成分的活性预期之外的不良反应…6抗生素杂质的一般特点7杂质含量控制高纯度低纯度杂质控制纯度控制杂质含量、种类各种潜在杂质杂质谱控制强调通过主成份纯度，间接控制其余杂质强调杂质含量、个数的直接控制各种潜在杂质的系统控制杂质控制的两次飞跃药理毒理研究结果

杂质控制限度确定

数据积累和分析

临床试验结果

分析方法的建立与验证杂质研究与控制的基本思路与策略杂质谱系统分析8各种潜在杂质及其可能的来源基于QbD理念的杂质控制策略

杂质谱分析9依据文献报道（国内外药典等）锁定基本杂质依据制备工艺，分析潜在的工艺杂质基于结构特征，分析可能的降解产物通过强制降解试验，验证降解产物的存在与检出与原研市售品的杂质情况对比研究，明确杂质异同…杂质来源的分析论证

—杂质谱分析的切入点1011起始原料空间构型原料药工艺发酵菌株起始原料活泼基团●起始原料组分与纯度特定副反应特定工艺杂质特定结构单元头孢菌素C-3位水解开环降解差向异构化顺反异构化酯类水解发酵工艺半合成工艺发酵工艺提取精制制剂工艺过程辅料影响工艺过程工艺杂质降解产物抗生素杂质谱分析基本路径

杂质谱概念的引入，进一步厘清了抗生素杂质研究与控制的基本思路

以终为始以源为始

避免了高风险杂质失控

被动控制主动控制实现了杂质的根本控制

个别控制系统控制全面掌控各种潜在杂质12杂质谱分析—由“以终为始”到“以源为始”案例：基于杂质谱分析，四个具有遗传毒性警惕结构的潜在杂质需要高度关注，但最初建立的分析方法未全部检测到，鉴于其风险程度，重新建立针对性方法检出，在毒理学评估基础上，进行了严格控制（杂质对照品法，ppm水平）。基本化学原理：所有“苯胺”在后续步骤中都会发生反应；因此，所有潜在的遗传毒性中间体都会发生反应。四种都具有相同苯胺官能团，导致潜在的遗传毒性确定毒理学关注的限度（阈值）（TTC=1.5μg/天）torcetrapib的TTC是25ppm13案例：FLQMS有关物质的研究与控制

改进：普通C18柱、等度洗脱特定C18柱、梯度洗脱

结果：检出两个高含量杂质。Minutes04812162024283214杂质谱分析—由“被动控制”到“主动控制”进一步的研究：新检出两个超鉴定限杂质结构研究与工艺控制建立LC－DAD－MS方法对新检出的两个超鉴定限度杂质进行了结构推断。杂质谱分析--从杂质结构及制备工艺入手分析其来源。从反应条件与杂质含量的关联性研究为切入点，研究确定了工艺控制要素，在过程控制阶段从根本上把控产品质量。15超鉴定限度杂质的结构推断493.9,

493.847A452.1452,268B471.2,471.347

16

杂质A的来源分析6-APA在特定条件下扩环生成7-ADCA，成为6-APA物料中的一种杂质。7-ADCA在后续反应中与氟氯酰氯生成杂质A17杂质A的工艺控制措施控制思路：由于杂质A来源于起始物料6-APA，严加6-APA的杂质控制水平可以从源头上降低该杂质的水平。研究数据：具体措施：从供应商中选用质量符合7-ADCA小于等于##%的6-APA作为起始原料，有效控制氟氯西林钠产品的杂A质水平。批号6-APA中7-ADCA含量（%）杂质A含量(%)1628Q0.842.844123D2.023.981206E1.152.972435U0.1020.0740896B0.080.0681402R0.260.24318

杂质B的来源分析6-APA与氟氯酰氯生成氟氯西林酸，氟氯西林酸在碱性条件下降解，生成杂质B。

[OH-]，H2O氟氯西林酸杂质B6-APA氟氯酰氯19杂质B的工艺控制措施控制思路：氟氯西林酸与异辛酸钠成盐过程中，局部碱性过强，降解产生杂质B—控制异辛酸钠的流加程序和搅拌速度，避免因局部过碱。研究数据：具体措施：控制搅拌转速##转/分钟，以##L/h流速继续流加剩余异辛酸钠溶液，当流加到##分钟时，调整搅拌转速到##转/分钟，流加结束后，控制异辛酸钠残留##%，检测合格后继续以##转/分钟的搅拌转速搅拌##小时，结晶结束。批号成盐及结晶工艺杂质B含量(%)0235QCY-1-JJ-22.310865YCY-3-JJ-24.671108TCY-1-JJ-12.850287BCY-2-JJ-20.0240965WCY-2-JJ-30.05620

有效控制杂质的基本思路与策略

在杂质谱分析指导下，从杂质产生的源头入手，优化制定合理的物料控制、生产过程控制措施和包装贮藏条件，从根本上优化控制杂质产生的因素，实现杂质的有效控制。21

22杂质谱分析—由“个别控制”到“系统控制”

23分析方法系统适用性专属性检测限EP7.0符合杂质A不出峰，其它峰都能相互分离。杂质B、杂质F为0.05%；左氧氟沙星、杂质E为0.025%；杂质C为0.015%。USP34符合左氧氟沙星、杂质G为0.02%；杂质B、杂质C、杂质E、杂质F为0.01%。JP16符合杂质A不出峰，杂质B与E峰之间的分离度为0.85，两峰之间不能完全分离。/申报标准符合杂质均能出峰且能相互分离。杂质A、杂质B的检测限为0.006%；左氧氟沙星、杂质E的检测限为0.003%；杂质C、杂质F的检测限为0.002%。分析方法的选择与验证

24中试及商业化产品杂质检出情况样品批号杂质名称DCC/p>

DC-0404-10070021107A05杂质B（RRT:0.3）未检出未检出0.02%未检出未知杂质1（RRT:0.4）0.03%0．03%0.03%0．03%杂质C（RRT:0.5）未检出0.02%未检出0.02%杂质H（RRT:0.8）0.02%未检出未检出未检出杂质E（RRT:0.9）0.08%0.07%0.05%0.06%杂质F（RRT:1.5）0.02%0.02%0.02%0.02%未知杂质2（RRT:1.7）0.03%0.03%0.03%0.03%杂质A（RRT:1.9）未检出0.02%未检出未检出总杂质0.16%0.15%0.13%0.14%

25质量标准--各种杂质的系统控制杂质各称EP7.0USP34JP16ChP2010本品申报标准杂质控制限度杂质A消旋体≤0.2%//≤0.3%≤0.1%杂质B消旋体≤0.2///≤0.1%杂质C消旋体≤0.2%≤0.3%//≤0.1%杂质D消旋体≤0.2%///≤0.1%杂质E消旋体≤0.2%≤0.3%/≤0.2%≤0.2%杂质F消旋体≤0.2%≤0.3%//≤0.1%杂质G/≤0.8%≤0.4%≤1.0%≤0.5%杂质H/≤0.3%//≤0.2%任何未知杂质≤0.1%≤0.1%≤0.1%≤0.1%≤0.1%总杂质≤0.5%（异构体除外）≤0.5%≤1.0%（异构体除外）≤0.5%（异构体除外）≤0.5%抗生素杂质控制的基本思考总体思路：杂质谱与生产要素

生产菌株、工艺要素与杂质和组分针对性的关联性研究发酵后合成路线的长短、起始物的复杂性—发酵起始原料及有关物质（组份）、合成副产物、合成中间体和降解产物等

起始原料内控—含量、组份及分布、有关物质（特定杂质、非特定杂质及总杂质）关键中间体内控—明确的杂质和单个未知杂质及总杂质

组分与杂质活性成分的一部分，还是应该被认为是杂质新抗生素与仿制抗生素探索性研究∮对比性研究

2627各种潜在的和实际存在的杂质的研究论证：根据杂质谱分析，产品将出现何种杂质？组分与杂质工艺杂质与降解产物毒性杂质与一般杂质生产过程中如何针对性控制或去除？效果如何？质量标准中的分析方法杂质可接受性的依据文献依据试验依据相关论证标准控制的杂质—哪些？限度？每个明确的已知杂质每个明确的未知特定杂质基因毒性与一般毒性杂质特定杂质与非特定杂质…任何非特定杂质（≤鉴定限度）总杂质28新抗生素—探索性研究的基本思路28

杂质限度：根据其来源、类别、结构信息等因素，必要的毒理学研究乃至临床研究中各批次试验样品的杂质组成情况综合考虑，针对性控制。

与母体化合物结构并不密切相关的杂质—参照化学合成药物杂质限度要求。CFDA0.15%与母体化合物结构密切相关的杂质—适当放宽。EMA0.50%与母体化合物结构密切性—DAD、LC-MS、…2930抗生素杂质限度类别报告限度（%）鉴定限度（%）界定限度（%）原料药制剂原料药制剂原料药制剂半合成抗生素0.05※(≤2g);0.03※※0.10.10（或1mg）※；0.05※※0.20.15（或1mg）※；0.05※※0.2发酵单组份抗生素0.100.150.150.20.150.2发酵多组分抗生素0.100.150.150.20.50/0.150.50/0.15※日剂量≤2g，※※日剂量>2g，（）取最小值原料药杂质限度

31某原料药日最大用量为0.5g，与母体结构不密切杂质报告限度=0.05%

鉴定限度=0.10%

界定限度=0.15%

或1.0mg（TDI）1)考虑响应因子问题33杂质谱复杂、难以充分纯化、治疗时间有限对于国内外药典和同类品种标准已明确控制的毒性杂质或降解产物，应进行相应的研究与控制。现有技术无法鉴定超鉴定限度杂质，至少提供相关结构信息表明其归属：母体化合物、某侧链…，并作为特定的未知杂质使用适当的分析标识进行识别和控制。全新抗生素新结构杂质—尚应基于毒理学乃至临床研究提供的相关信息不同种类抗生素限度也不尽相同改善纯化、降低杂质含量—可能比提供安全性资料更便捷

抗生素杂质限度要求的相关考虑33考虑生产工艺与分析方法的正常波动、产品的稳定性选择工艺相对成熟、多批数、批量接近商业化生产的样品杂质的限度：平均值+3×SD在杂质的安全性（毒理、临床研究）得到充分验证前提下杂质的标准控制限度：

仿制抗生素—对比性研究的基本思路35分析方法：结合产品杂质谱，与ICH成员国药典收载的检测方法进行检测能力和样品测定结果的对比研究，优选专属性好、灵敏度高，能够充分检出相关杂质的检测方法。分离技术（如HPLC法）与质谱分析（或二极管阵列检测）相结合或使用分析标识物（如杂质对照品），以便从色谱行为、UV特征、分子量及分子碎片特征等信息共同把握其物质一致性。分析方法的定量限不应高于(≤)报告限度。

3637对照药—仿制研发的基础和标杆以列表形式，采用多种检测手段，如DAD、LC-MS等技术手段逐个进行对比，对样品与原研品进行所有杂质种类、含量及分布的比较和分析。

特定杂质中国药典、ICH成员国药典规定控制的同品种特定杂质，须进行相同的研究与控制。非特定杂质与原研产品相同的杂质，含量不超过质量标准（药典等）规定或原研产品—可接受。相同杂质如超出标准规定，或出现原研产品中没有的新杂质—按照新抗生素杂质研究的思路与策略，消除或降低其含量，或进行安全性求证，制定合理限度。

38对比研究遗传毒性：泛指各种因素（物理、化学因素）与细胞或生物体的遗传物质发生作用而产生的毒性。致突变性：与DNA相互作用产生直接或潜在的影响，使基因突变（bacterialreversemutation（Ames）试验）致癌性：具有致癌可能或倾向（需要长期研究！）警示结构特征遗传毒性物质：很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤的发生。甲磺酸奈非那韦（Viracept）的故事38遗传毒性杂质：杂质控制中的重点关注

ICHQ3A(R2)ImpuritiesinNewDrugSubstances,2006ICHQ3B(R2)ImpuritiesinNewDrugProducts,2006EMA：GuidelineontheLimitsofGenotoxicImpurities，2006EMA：QuestionsandAnswersontheCHMPGuidelineonthelimitsofgenotoxicimpurities,2008FDA:GuidanceforIndustry:GenotoxicandCarcinogenicImpuritiesinDrugSubstancesandProducts:RecommendedApproaches.Draft,200839遗传毒性杂质相关的指导原则

ICHM7DraftconsensusguidelineassessmentandcontrolofDNAreactive(Mutagenic)impuritiesinpharmaceuticalstolimitpotentialcarcinogenicriskCurrentStep2version，

2013年2月6日始，征求意见至2013年4月

最终发布时间？40提供了一个可用于遗传毒性杂质鉴别、分类、定量分析和控制的可行性框架限制潜在的致癌风险提供安全性评估和质量风险控制的理念对ICHQ3A和Q3B的补充41

ICHM7药物研发过程中，遗传毒性杂质的可接受水平是多少?上市产品遗传毒性杂质的可接受水平是多少?是否可以采用毒理学关注阈值(TTC)来规定遗传毒性杂质的水平?

计算TTC时，是否可以将多个遗传毒性杂质合并计算?

哪些是可接受的特殊情况？日摄入量大于TTC的情况?信息参考根据风险级别实施分类管理1类已知的有致突变性和致癌性物质

-致突变和致癌性数据为阳性。基于文献中报告的动物/人体毒性。现有的公开数据库，如ToxNet、NTP、InChem、BG‐Chemie、日本现有化学物质数据库和/或市售数据库，如VITIC和Leadscope。2类已知的致突变性，但致癌性未知的物质

-致突变数据为阳性，但致癌性未知。如已知的细菌突变Ames试验结果阳性，但是未报告啮齿类动物致癌性数据。42433类含警示结构，与API结构无关联，无致突变性数据

-有警示结构，有潜在遗传毒性风险。Q(SAR)系统显示警示结构具有遗传毒性，但与活性物质结构无关。如果细菌突变Ames试验阳性，划为2类，如果细菌突变Ames试验阴性，划为5类。4类含警示结构，但与无致突变性的API结构相似-有警示结构，但与原料药和原料药结构相似物有关，而细菌突变Ames研究显示此类物质呈阴性。5类无警示结构，或有充分的数据证明其警示结构无致突变性-没有警示结构，

没有遗传毒性的文献报告，或在细菌突变Ames试验阴性，或者有充分的数据证明与警示结构不相关。遗传毒性警示结构：45A为烷烃基、芳香基或H；X为F、Cl、Br、I；EGW为吸电子取代基：氰基、羰基或酯基等。限度控制1）PDE法（有阈值效应的遗传毒性杂质）：在超过一定限度时才会产生遗传毒性。限度确定参照残留溶剂限度的计算方法，根据相关动物的无可见效应剂量（NOEL）计算其可接受的日暴露量（PDE），再根据药品的最大日剂量计算出杂质的接受限度。2）TTC法（无阈值效应的遗传毒性杂质）：引入毒理学关注阈值（TTC）的概念：假设患者终生用药的癌症发生概率不超过10万分之一，从高浓度下进行的致癌性实验数据线性外推到极低浓度得到的一个理论值。此类杂质，如果每日摄入量低于1.5ug，那么患者因服药导致癌症发生的额外风险，可以忽略不计。4546举例：PDE法—环氧乙烷大鼠TD50为21.3mg/kg按照1/100,000肿瘤发生率，TD50为1/50,000发生率21.3mg/kg÷50,000=0.42μg/kg0.42μg/kg/day×50kgbodyweight=21.3μg/person/dayPDE为21.3μg/person/day某制剂100mg/day,环氧乙烷控制限度应为0.021%（210ppm）。TTC法—甲磺酸酯（甲酯、乙酯等）以TTC1.5ug/日计算。某制剂300mg/日，甲磺酸酯控制限度应为0.0005％（5ppm）。3)引入与Less-Than-Lifetime(LTL)暴露相关的可接受限度：基于TTC可接受的限度为1.5μg/day是假设患者终生服药的基础上得出的理论值，在LTL遗传毒性杂质限度的范围应为：

1.5μg/day×365days×70years（25,550days）

=38.3mg

设计出平均分配在累积暴露天数中的方法，对于临床研究和上市药物不同用药时间可接受的限度（摄入量）：

474）含有多个遗传毒性杂质的限度要求：

基于TTC原理，当原料药中有含有多个遗传毒性杂质时，按照下所描述的进行限制。