第5章.多肽和蛋白质类药物

15多肽与蛋白质类药物

5.1多肽与蛋白质类药物概述

5.2多肽与蛋白质类药物的生产方法

5.3重要的多肽与蛋白质类药物的制备

2多肽和蛋白质，从化学结构上无本质区别，都是氨基酸通过酰胺键（肽键）连接而成的化合物。一般讲组成化合物的氨基酸数目在50个以下的称为多肽，50个以上的称为蛋白质。多数多肽无特定的空间构象，某些多肽也有一定的构象，但其构象的坚固性远不如蛋白质，其构象的浮动性很大。蛋白质都有稳定的高级结构，这是由于组成肽链的氨基酸数目增大到一定程度后，才可能具备高级结构所需要的足够的次级键作用力。5.1多肽与蛋白质类药物概述35.1.1多肽类药物多肽类生化药物是以多肽激素和多肽细胞生长调节因子为主的一大类内源性活性成分。第一个人工合成的有生物活性的多肽是1953年的催产素20世纪50、60年代研究的重点是脑垂体分泌的多肽激素。20世纪70年代，神经肽和细胞生长调节因子的研究进入高潮。4催产素脑垂体分泌多肽激素神经肽5目前主要的多肽类药物：1．多肽激素（1）垂体多肽激素：促皮质素（ACTH），促黑激素（MSH）,脂肪水解激素（LPH），催产素（OT），加压素（AVP）。（2）下丘脑激素：促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF），促性腺激素释放激素（LHRH）。（3）甲状腺激素：甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。（4）胰岛激素：胰高血糖素，胰解痉多肽。（5）胃肠道激素：胃泌素，胆囊收缩素-促胰激素（CCK-PZ），肠泌素，肠血管活性肽（VIP），抑胃肽（GIP），缓激肽，P物质。（6）胸腺激素：胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子62.多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心钠素（ANP）。3.含有多肽成分的其它物质

骨宁，眼生素，血活素，氨肽素，妇血宁，脑氨肽，蜂毒，蛇毒，胚胎素，助应素，神经营养素，胎盘提取物，花粉提取物，脾水解物，肝水解物，心脏激素等。目前主要的多肽类药物：75.1.2蛋白质类药物8包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等。作用方式从对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫,替代疗法和抗凝血剂以及蛋白酶的抑制剂等多种领域。已实现产品工业化的有：

胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、t-PA、TNF等。9发展方向对一些蛋白质类生化药物进行结构修饰；应用计算机图像技术研究蛋白质和受体及药物的相互作用；发展蛋白质工程和设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物，并使其起到增强或增加选择性疗效的作用；一些蛋白质和生化药物具有一定的抗原性、容易失活、在体内的半衰期短、用药途径受限等难以克服的缺点。10目前主要蛋白质类药物：1蛋白质激素（1）垂体蛋白激素：生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。（2）促性腺激素：人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清促性腺激素（SGH）。（3）胰岛素及其它蛋白质激素：胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。2血浆蛋白质

白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）等。3蛋白质类细胞生长调节因子

干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、神经生长因子（NGF）等114粘蛋白胃膜素，硫酸糖肽，内在因子等。5胶原蛋白

明胶，阿胶，冻干猪皮等。6碱性蛋白

硫酸鱼精蛋白等。7蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂等。8植物凝集素

PHA，ConA。目前主要蛋白质类药物：125.2多肽与蛋白质类药物的生产方法提取分离纯化法化学合成法基因工程法135.2.1提取分离纯化法

5.2.1.1材料选择来源：动植物组织和微生物等。原则：选择富含所需蛋白质多肽成分的，易于获得和易于提取的无害生物材料。考虑因素：原料的种属、原料来源发育生长阶段、生物状态原料解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞。14蛋白质、酶及核酸在肝细胞内的分布情况155.2.1.2提取概念：分离纯化的第一步，是将目的物（制备物）从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐溶液或有机溶剂）。要求：最大限度的将有效成分提取出来。关键：溶剂的选择。选择标准：对被制备物有最大的溶解度，并在提取时尽可能减少不必要的成分。常用手段：调整溶液的pH值、离子强度、溶剂成分配比和温度范围等。16提取罐175.2.1.3蛋白质分离纯化的一般方法（重点）18总目标：增加制品的纯度或比活性，即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性（以活性单位/mg蛋白表示）。方法：设法除去变性蛋白质和杂蛋白质，希望所得蛋白质的产量和纯度达到最高值。纯化收率问题值得考虑。

191.根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质

原理：两性物质的等电点会因条件的不同而改变。利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性制备或沉淀蛋白质。

将pH调到所需要蛋白的等电点而使该蛋白沉淀下来，但是蛋白质在等电点处仍然有相当的溶解度，故而靠等电点沉淀不能完全将两种蛋白质分开。实际工作中，往往将等电点沉淀法和盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。

优点：操作简单，试剂消耗少，给体系引来的杂质少，可除去等电点相距较大的杂蛋白，也可配合热变性操作。缺点：等电点两侧的pH值是否使所提纯的蛋白质变性，以及不需要的主要杂蛋白的等电点范围。

20以不同蛋白质的等电点的差异进行分离。凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。载体两性电解质：是一系列物质的混合物，此混合物各组分的等电点要各不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）。最常用是3.0-10.0范围，还有3.0-7.0，5.0-10.0。混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物。要求各组分的分子量要小，易与蛋白质分离。等电聚焦21通电后，在介质中由于H+，OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。即pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。22注意事项：

时间相对长对分离有利也可用来测定蛋白质的等电点。232.根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质采用透析法、超滤法、凝胶过滤法及离心法等将蛋白质与其它小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。透析法：应用最早的膜分离技术。特点是用于分离两类分子量差别较大的物质，即将分子量103级以上的大分子物质与分子量在103级以下的小分子物质分离。多用于除去大分子溶液中的小分子物质和盐类，也称脱盐

24透析法25超滤法：

以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。超滤膜不以孔径大小而是以截留分子量作为指标，超滤膜的标准截留分子量是指截留率在90%或95%时对应的分子量。避免浓差极化现象。26凝胶过滤又叫分子筛层析：分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可以人工合成。根据网孔不同可制成不同的规格。具备条件：惰性、水不溶性、能高度水化。27常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex)，型号：G200,G150,G100,G75,G50,G25,G15.分离大蛋白质、小蛋白质和除盐。琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose，美国Bio-GelA)孔径大，用于分离大分子物质。聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）28原理：分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来。所以大分子物质迁移速度快。小分子物质通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。293031密度梯度离心32电泳法区带电泳纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳细丝电泳粉末电泳凝胶电泳支持物为溶液，很少用。自由界面电泳琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳免疫电泳3334蛋白质分子越小，迁移率越大，迁移距离越远35垂直板电泳36蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳37加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量硫基乙醇，则蛋白质的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。硫基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。此时SDS以其烃链和蛋白质分子的侧链结合成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。38结果导致：由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远大于蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量大小成正比变化。由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质比，并具有相似的构象，因而有如下公式：

lgM=k1-k2µR(k1和k2为常数，µR为相对迁移率）实际测定时，以几种标准单体蛋白质分子量的对数值对其µR作图，回归出k1和k2，然后根据样品的µR值，从标准曲线上就可以查处其分子量。39SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳40二维蛋白质电泳413.根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。同一特定条件下，不同的蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条件，可以有选择的控制某一种蛋白质的溶解度，达到分离的目的。分离方法：蛋白质的盐溶与盐析，结晶和低温有机溶剂沉淀法。有机溶剂沉淀法：最常用的有机溶剂是乙醇和丙酮。分辨率比盐析法好，溶剂容易除去。但有机溶剂易使蛋白质和酶变性，注意低温操作。424.根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。离子交换层析：是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作。分为阳离子交换和阴离子交换。树脂类：分离氨基酸，孔径小

纤维素类：分离蛋白质，孔径大43离子交换剂由大量带电荷的侧链和不溶性的树脂结合而成。阴离子树脂侧链电荷为正，可与带负电荷的蛋白结合；阳离子树脂侧链电荷为负，可与带正电荷的蛋白结合。44优点：较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨力等。控制点：缓冲液、上样液的pH值及电导值。45通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。465.根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质

亲和层析法：利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异性的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。优点：条件温和，操作简单，效率高，特别对分离含量低又不稳定的蛋白质。缺点：不是任何蛋白质都有特定的配基，而且针对某蛋白质还需要制备含有其配基的特定层析载体及特定相应的层析条件。47配基：特殊配基通用配基（一类物质的分离）配基的选择：足够大的亲和力、专一性、化学活性非专一性吸附：吸附剂上的离子基团和疏水基团。基本过程：配基固定化吸附样品样品解吸。脱附方式：改变蛋白质的带电状态改变环境溶液的pH改变环境溶液离子强度4849固相化金属亲和层析（IMAC）：是新发展的一种亲和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素（如Cu2+，Zn2+)形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。一些蛋白质如胰岛素、催乳素、生长素以及酶类都可用专一的抗体作为配基进行纯化，染料配基亲和层析亦用于IL-2的纯化。50

6.根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来

纯化蛋白质

蛋白质上的疏水区能够与吸附剂上的疏水性基团结合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂，提高洗脱剂的pH等方法将蛋白质洗脱下来。疏水性层析：高电导的条件下上样层析，疏水性基团较多的目标蛋白质与配基相互作用而被吸附，缺乏疏水基团的蛋白质首先被洗脱流出。然后，再降低洗脱液的电导性，使蛋白质的疏水性降低，目标蛋白质就从树脂上被洗脱下来。控制点：缓冲液和上样液的pH值和电导值。51

7.根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋

白质

逆流分溶：一种以化合物在两个不相容的液相之间进行分配为基础的分离过程。利用逆流分配色谱，在分离垂体激素、氨基酸、DNA等产品时取得较好的效果。52

8.根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响

来纯化蛋白质

蛋白质易受pH、温度、酸碱、金属离子、蛋白质沉淀剂，络合剂等的影响，因为各种蛋白质都存在差异，可利用这种差异来分离纯化蛋白质。如白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67℃高温，而其他蛋白质变性；球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以与利凡诺作用，形成络合物而于其他蛋白质分离；细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀，而保存其活力；539.根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质几个概念：吸附作用：物质从流体相（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。吸附法：利用吸附作用将样品中的活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法叫做吸附法。正吸附：用吸附剂吸附提取液中的有效成分叫正吸附。负吸附：用吸附剂吸附提取液中的杂质成分叫负吸附。54主要常用的吸附剂：①活性炭：吸附注射液中的色素、有味物质、酸、碱、盐和热原等；用于生化药物的分离。②人造沸石：吸附细胞色素C。③磷酸钙凝胶：常用于蛋白质纯化；如吸附胰岛素；制备链激酶时用磷酸钙处理去除杂蛋白。④白陶土：活性物质的纯化分离吸附剂；助滤剂与去除热原质的吸附剂；吸附一些分子量较大的杂质。⑤氢氧化铝凝胶：蛋白质和酶的制备中作为吸附剂。⑥氧化铝：醇、酚、生物碱、染料、甾体化合物、苷类、氨基酸、蛋白质以及纤维素等物质的分离。⑦硅胶：芳香油、萜类、固醇类、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性化合物、磷脂类、脂肪类、氨基酸等的吸附分离。⑧皂土：带点部位能结合金属离子、多肽和碱性蛋白，是核酸酶的抑制剂。

5510.根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质超氧化歧化酶（SOD）是一种酶蛋白，能抵抗蛋白酶水解，所以可用蛋白酶降解其他蛋白质，进一步纯化SOD。565.2.1.4蛋白质的分离与纯化1.分离纯化早期使用的方法的选择从低分辨率到高分辨率。如萃取、沉淀、吸附等。2.各种分离纯化方法的使用顺序

减少工序，提高效率。

各种分离方法的交叉使用对于除去大量理化性质相近的杂质也较为有效。

57在生物样品蛋白质的提取物中，除有数千种不同性质的蛋白质外，还有核酸（DNA和RNA）、多糖、脂质及小分子混在一起。

多种方法可用来分离纯化蛋白质，一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离。58（1）前处理分离并纯化蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。

细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是借共价键连接而成的肽聚糖囊状分子，非常坚韧。破碎细胞壁的常用方法有超声波震荡，砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织或细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。生物样品碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。59（2）粗分级分离当获得蛋白质提取液后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。

60（3）细分级分离

经过粗分级分离以后，样品一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。

进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层吸、亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。

依次运用其中的若干方法，将可逐步纯化出几乎任何一种蛋白质。如仔细选择方法，并对分离条件和蛋白质稳定性的保持给予恰当的，纯化将会获得合理的效率、速度和纯度，同时保持该多肽的生物学活性和化学完整性。

616263盐析后采用吸附法，盐离子过多会影响吸附效果，如果中间增加透析脱盐一步，又使操作大大复杂化。怎么办？

某些杂质在各种条件下的带电性质可能与制备物相似，但分子大小与形状与制备物相差较大；而另一种杂质的分子大小形状可能与制备物相似，但在某种条件下与制备物带电性质不同。示例643.分离纯化后期的保护措施后期产品的损失主要有：玻璃仪器的吸附、操作过程中样品液体的残留、空气的氧化或者某些事先无法了解的因素。常常需要加大原材料的用量，并在后期纯化工序中注意保持样品溶液较高的浓度，以防止制备物在稀溶液中变性，有时加入一些电解质以保护生化物质的活性，减少样品溶液在器皿中的残留量等。654.对分离纯化每一步骤方法的优劣进行综合评价分辨本领重现性回收率

好的分离纯化方法应是提纯倍数和回收率同时得到较大提高。必须指出，整个分离纯化步骤时连续进行的，有时前一步虽然提纯程度和回收率不高，但它是必需的，主要为下一步提供更有利的分离纯化基础。66蛋白质分离纯化工艺中需要考虑的三个方面：（1）时间因素：蛋白质反应达到平衡的时间，避免蛋白质变性、微生物污染等（2）选择离子交换层析条件的程序（3）蛋白质分离纯化的可能的技术组合67685.2.1.5溶液中蛋白质浓度的测定根据溶液中蛋白质的物理、化学性质，如折射率、相对密度、紫外光吸收来测定；化学反应方法：如凯氏定氮、双缩脲反应、福林-酚反应测定；染色法：如氨基黑、考马斯亮蓝测定；荧光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。691.紫外法利用蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸残基在280nm处有吸收峰，进行比色测定。特点：灵敏度较高（最低测定值10µg），操作简单，但仪器价格昂贵，易受其他因素干扰（尿素、胆红素），需将蛋白质分离纯化后再测。70（1）280nm光吸收法：取3ml蛋白质溶液，以缓冲液作为对照，用光径为1cm的石英比色皿，在280nm处测定光吸收值。通常以浓度为1mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值，可用标准曲线直接测出样品中蛋白质浓度。（2）280nm和260nm的吸收差法若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的核酸类物质，由于核酸在260nm的光吸收比280nm更强，会造成较大干扰，所以利用吸收差计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A26071（3）215nm和225nm的吸收差法：蛋白质的肽键在200-250nm处有强的紫外光吸收，其光吸收的强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短光吸收越强。若选取215nm可减少干扰和光散射。这种光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差。因此，对稀溶液中蛋白质浓度的测定可用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：蛋白质浓度（mg/ml）=0.144(A215-A225)722.凯氏微量定氮法：在生物样品中，蛋白质含氮量相对恒定，为16%，即1g氮相当于6.25g蛋白质，由于其他非蛋白质含氮化合物所占的氮量甚微，故可通过测定样品中的含氮量来推算其蛋白质含量。特点：历史悠久（1883年），结果较准，但方法复杂、费时，一般不用于常规检测。733.双缩脲法：蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中与铜离子形成紫红色化合物，540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。

特点：简单、精密、准确（干扰因素较少），为首选方法，但灵敏度稍差（最低测定值100µg）

744.福林－酚试剂法：

Folin

1921年

首创，利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）起蓝色反应。1951年，Lowry对这个方法进行改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。750nm比色测定。特点：灵敏度高（最低测定值1µg），但易受还原性物质的干扰。755.考马斯亮兰G-250染色法：

考马斯亮兰G-250（带负电的染料）在酸性溶液中为棕红色，它与蛋白质（带正电）通过疏水作用结合后变为兰色，可在595nm比色测定。

特点：灵敏度高（最低测定值1µg）、反应快、操作简便、消耗样品量少，干扰因素少，但特异性不高（不同蛋白质之间的差异较大，且标准曲线线性较差）。765.2.1.6纯度检查难以从蛋白质制剂中检测出被污染蛋白质的原因被污染的蛋白质的量可能低于很多常规分析方法的检测极限蛋白质纯度是化学和物理学的概念，它和蛋白质所具有的生物活性有着更加复杂的关系。蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性，而这些因素的影响往往是一般纯度检查的方法所查不出来的。77各种细分级的方法都可以用于纯度鉴定。常用的各种电泳法。比较权威的有：等速电泳、梯度电泳、等电聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。沉降分析和扩散分析：测定沉降系数和扩散系数。溶解度恒定法：加入样品量为横坐标，样品溶解量为纵坐标，作图。如只有一个拐点，说明样品纯。78常用的蛋白质纯度检查方法1.HPLC和FPLC最常用的检查蛋白质浓度的方法。如美国药典中规定HPLC用于胰岛素的纯度检测。7980FPLC（fastproteinliquidchromatography)812.电泳法凝胶电泳呈现单一的区带，是纯度的一个重要指标，说明样品的荷质比（电荷/质量）是均一的。如果在不同pH下进行凝胶电泳都是一条区带，则结果更为可靠。SDS电泳法适合含有相同亚基的蛋白质的纯度检查。823.免疫化学法主要有免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析等。此方法适用于能产生特异性抗体的蛋白质，无论是检查所需要的还是被污染的蛋白质都适用。4.生物检测法利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定。这种方法接近动物临床所产生的生物学效应，因此实际意义更大。835.分光光度法（1）紫外分光光度法纯蛋白质的A280/A260为1.75，此法可检查有无核酸的存在。不同的蛋白质在紫外区的吸收峰有微小的差别。由于其特异性，可作为定性或定量测定的参考。（2）红外分光光度法由于蛋白质的分子结构有一定的能级而有别于其他非蛋白质的物质，故红外光谱为人们提供“分子指纹”。845.2.2多肽与蛋白质的化学合成20世纪50年代开始获得重大发展的。1965年中国科学家在世界上首次合成了胰岛素。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）进行。只能合成较短的肽链，对于合成蛋白质还有很多困难。而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，这也许是今后多肽合成的发展方向。液相合成法、固相合成法855.2.2.1多肽合成的一般步骤要实现控制多肽合成，必须事先把不应与接肽反应试剂发生作用的官能团，如N－末端氨基酸残基的自由－NH2，C－末端氨基酸残基的自由－COOH及侧链上的一些活泼基团，特别是巯基(－SH)等，加以封闭或保护。待肽链形成以后，再将保护基团除去。多肽合成的一般步骤包括：

氨基保护和羧基活化羧基保护和氨基活化接肽和除去保护基团86

氨基保护剂

苄氧羰酰（CbZ-

）

叔丁氧羰基（Boc-

9-芴甲氧羰基（Fmoc）

较强的酸解条件才能脱除

可用三氟乙酸TFA脱除可用哌啶-CH2Cl2或哌啶-DMF脱除

羧基保护剂通常是用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基上接上烷基。除去保护基可在室温下用氢氧化钠皂化法。875.2.2.2.肽的液相合成法阶梯伸长法

将带有R-O-CO-型保护基（Z、Boc等）的氨基酸（不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸，逐步增加的方法。这是合成比较小的肽或者肽段常用的方法。片断缩合法是小肽缩合成大肽的的方法。

88（1）阶梯伸长法①混合酸酐法

DDC法（N，N－二环已基碳二亚胺）。首先使N-端保护的氨基酸同DDC反应，形成酐后，加入另一个氨基酸，缩合成肽。（R1CO)2O＋R2-NH2

R1-CO-NH-R2②活化酯法带有氨基保护基的氨基酸对硝基芳香族酯，能与另一个氨基酸酯的氨基缩合成肽。H-Gly-OME＋Z-Leu－OC6H4NO2

Z-Leu-Gly-OME89（2）片断缩合法常用叠氮法，有较好的产品光学纯度（不消旋）。

小肽接成大肽时，为保证光学纯度，应尽量利用Gly和

Pro这两个氨基酸的C-末端接肽。905.2.2.3.肽的固相合成法1963年，R.BMerrifield创立了将氨基酸的C-末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链、合成蛋白质的固相合成法。固相法中，每步反应只需简单洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服了经典的液相合成法中每一步产物均需要纯化的困难，为自动化合成肽奠定基础。近几十年啦，固相合成多肽以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的优势而成为多肽与蛋白质合成中的一个常用技术。91Boc固相合成法：采用TFA（三氟乙酸）可脱除的叔丁氧羰基（Boc-）为α-氨基的保护基，已成功合成许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等，但是不适合合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类；Fmoc固相合成法：采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）基团作为α-氨基的保护基。Fmoc法和Boc法的根本区别是采用了碱可脱除的Fmoc作为α-氨基的保护剂，避免了强酸处理。肽的固相合成方法92多肽合成以后，由于在介质中存在副产物，因此仍存在有分离、纯化的问题，但这比在天然原料中进行纯化要方便的多。蛋白质分离纯化的一般技术手段可以酌情配合使用，如结晶法、层析法、等电点沉淀法、超滤法等。为避免失活，产品的干燥一般采用真空干燥或冷冻干燥。5.2.2.4合成肽链的纯化935.2.3基因工程法基因工程蛋白质药物的生产是一项十分复杂的系统工程，与制备基因工程药物的一般程序相似。945.3重要的多肽与蛋白质类药物的制备5.3.1胸腺素（thymocin）胸腺激素是一种重要的多肽类药物，与调节免疫功能有关。在所有的胸腺激素制剂中，对来自小牛胸腺的胸腺素组分5（即以小牛胸腺为原料，按一定的方法提取、纯化胸腺的第5种组分）的基础理论和临床研究最多。95（1）结构和性质胸腺素组分5是由80℃热稳定的40–50种多肽组成的混合物，分子量在1000~15000之间，等电点在3.5~9.5之间。根据等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名。共分为三个区域：α区包括等电点低于5.0的组分；β区包括等电点在5.0-7.0之间的组分；γ区则指其等电点在7.0以上者（此区内组分很少）。96对分离的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素，如胸腺素α1，无活性的称为多肽，如多肽β1。胸腺素组分5中，胸腺α1、α5、α7

、β3、β4

等具有调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内外免疫反应的活性组分。主要的生物学功能表现在：连续诱导T细胞分化发育的各个阶段，放大并增强成熟T细胞对抗原或其他刺激物的反应，维持机体的免疫平衡。97（2）作用与用途免疫调节剂。临床应用于原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；自身免疫病，如肝炎，肾病，红斑狼疮，类风湿关节炎、重症肌无力等；变态反应性疾病，如支气管哮喘等；细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老；肿瘤的辅助治疗。98（3）生产工艺99

（4）检验方法

活力测定，E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%，分子量15000以下。1005.3.2干扰素(interferon,IFN)（1）干扰素的种类定义：是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。功能：干扰病毒在细胞内的繁殖；还能抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能。分类：根据抗原性的不同，可分为三大类：α、β、γ三种型。重组干扰素-α的研究较为深入，其中干扰素-α2b是目前国际公认疗效最好、构效比最佳的干扰素-α。101

1957年由英国科学家Isaacs和Lindemann研究流感病毒时发现。分子量在18ku～100ku之间，等电点6.5～7.5。对乙醚、氯仿敏感，容易吸附到介质上。

102（2）干扰素的生物学活性与临床应用

①干扰素的广谱抗病毒活性慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、疱疹、病毒性角膜炎。②干扰素的抗肿瘤作用毛细胞白血病、艾滋病的Kaposi肉瘤、慢性髓样白血病。③干扰素的免疫调节活性④干扰素的副反应：流感样症状。103（3）干扰素的研究与生产现状①体外诱生干扰素制备工艺

仙台（Sendai）病毒诱导人白细胞生产人白干扰素。缺点：需要大量新鲜人血，来源非常困难，纯化工艺复杂，收率低，价格昂贵，并存在潜在的血源性病毒污染的可能性。1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市；104②人源转化细胞系培养生产工艺1975年，利用人工培养的转化细胞株代替人血白细胞，经病毒刺激后产生多种亚型混合的干扰素-α。20世纪80年代，IFNα-n1/Wellferon批准用于临床，是首次实现大规模商业化生产的。缺点：生物活性较低，20世纪90年代末退出临床应用。105③基因工程大肠杆菌发酵生产工艺20世纪80年代，人干扰素基因克隆并研制成功重组人干扰素-α2。工艺特点：发酵过程；表达产物为非活性包涵体形式；干扰素在来源上脱离了人血，且纯度和活性比人白干扰素有所提高，成本明显降低。为第一代基因工程干扰素。缺点：生物合成、纯化和制剂阶段均使用一些动物或人血液提取成分，没有摆脱潜在的传播血源性疾病的危险。106④基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺宿主：腐生型假单孢杆菌（Pseudomonasputida）上市产品：IFNα-2b/安福隆；表达产物：具有天然分子结构和生物活性的、无糖基化可溶性蛋白质；优点：发酵周期短：几个小时；无需变性、复性过程：获得有活性的产品；纯化过程：淘汰了抗体亲和层析，制剂中采用非人血清白蛋白新型保护剂，使得整个制造过程中不使用任何血液提取成分，解决了大肠杆菌表达干扰素的缺陷，干扰素生物学活性和纯度更高。这是第二代基因工程干扰素。1071986年美国FDA批准Roche公司基因工程干扰素-α2a和Schering公司的干扰素-α2b进入市场，治疗白血病。中国预防医学科学院病毒所、卫生部长春生物制品研究所、中国药品生物制品检定所合作研发了第一个基因工程产品，基因工程干扰素-α1b滴眼液，于1990年进入市场。随后又共同研发了基因工程干扰素-α1b注射液和基因工程干扰素-α2b注射液，于1992年进入市场。基因工程干扰素-γ

注射液和天津华立达生物工程公司的基因工程干扰素-α2b也分别于1995年和1996年进入市场。国内30多家公司从事基因工程干扰素的生产和销售，2005年销售额达到15亿元。目前全球的年销售额在20亿美元左右。108（4）干扰素的生产工艺利用血库血大量生产人血细胞干扰素的工艺基因工程假单胞杆菌发酵生产干扰素的工艺109利用血库血大量生产人血细胞干扰素的工艺110基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺基因工程假单孢杆菌的构建与特性基因工程菌发酵生产干扰素的工艺过程干扰素发酵过程的控制要点

111（1）基因工程假单孢杆菌的构建①干扰素α-2b基因的克隆：

从感染病毒的人血白细胞中分离出干扰素α-2b基因的mRNA，由逆转录酶合成cDNA，PCR，基因连接质粒。将连接杂合体转化到E.coli感受态细胞中，并用氨苄青霉素和四环素筛选出抗性克隆，获得编码人IFNα-2b基因序列（501bp，165aa）。②表达载体的构建：

IFN基因与广泛的宿主载体pAYC37连接，筛选出序列正确的表达载体pVG3。③工程菌的构建

将表达载体导入假单胞杆菌中，筛选高表达、稳定遗传的干扰素工程菌，获得原始菌种。

112（2）基因工程假单孢杆菌的特性①具备宿主细胞假单孢杆菌的特征细胞形态：革兰氏阴性，可运动，有荚膜，无芽孢，杆状，长度3~5μm。菌落特征：LB琼脂培养基上，30℃培养24小时，菌落直径2.5~3.0mm，灰绿色半透明状，具有粘稠性。生化特性：不能将明胶、淀粉、聚-β-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为丝氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、D/L-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。113②工程菌特征DNA中G+C含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨苄青霉素的抗性。③生产能力具有生产干扰素-α2b的能力，其放射性免疫学效价不能低于2.0×109IU/L。114（3）菌种库的建立、传代及保存每批主代菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于－70℃以下温度保存。1152.基因工程菌发酵生产干扰素的工艺过程

116

①菌种制备取-70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），室温下融化。接入摇瓶培养，30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：吸光值测定和发酵液杂菌检查117②种子罐培养接种：将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%。培养：温度30℃，pH7.0控制：级联调节通气量和搅拌转速，DO30%，培养3～4h，OD大于4.0，转入发酵罐中，进行二级放大培养。检测：显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌。118③发酵罐培养接种：将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%。培养：温度30℃，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速前4h，30℃

，pH7.0,，DO30%。

4h后，20℃，pH6.0，DO60%，5～6.5h。检测：发酵液杂菌检查。终点控制：当OD值达9.0±1.0后，5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

119④菌体收集菌体收集：将已降温至20℃以下的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。菌体保存：于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。1203.干扰素发酵过程的控制要点（重点）假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可用两段培养的策略进行过程控制。

121种子培养基的营养成分丰富，尤其是氮源含量比较高（即C/N比低）。发酵培养基氮源含量比种子培养基稍低（即C/N比高）。假单胞菌在以水解酪蛋白、酵母粉等组成的营养丰富的合成培养基中发酵时，生长快，且表现出较高的质粒稳定性。发酵需要合适的生长pH范围，而在其生长繁殖过程中，产生的代谢产物会引起培养基pH的改变，因此要考虑培养基的pH调节能力，可用K2HPO4/KH2PO4缓冲液。①培养基组成122②溶解氧控制溶氧不足时，表现为乙酸、乙醇等发酵副产物的积累，同时造成菌体生长、生产速率下降。研究表明：15%的溶解氧可满足基因工程假单孢杆菌的生长需求，但70%以上的溶解氧水平才能保证菌体中干扰素-α2b的大量合成，其产量是15%溶解氧的6倍，而菌体生长速率未发生明显的变化，质粒的稳定性大大提高。因此，分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。可通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。123假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。最佳生长温度则为30℃，但产物合成温度控制在20℃可以有效防止干扰素-α2b的降解，且质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降。因此，在培养后期降温可以减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。

③温度控制124④pH值发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。菌体生长在pH6.8时最佳，干扰素γ的最佳表达pH为6.0。所以采用两段培养法，在生长和生产阶段分别控制各自最佳pH。干扰素-α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。1254.基因工程干扰素的分离工艺过程与控制分离工艺过程：菌体发酵之后进行，主要是分离细胞和培养液，破碎细胞和释放干扰素（干扰素是胞内），浓缩产物和除去大部分杂质。纯化工艺过程：在上述初级分离基础上，用各种高选择性手段（各种色谱技术）将干扰素和各种杂质尽可能分开，使纯度达到要求，最后制成成品。主要问题：保持干扰素的活性。126（1）干扰素分离工艺过程①

菌体裂解纯化水配制裂解缓冲液，降温至2℃～10℃（pH7.5）；使用保护剂：EDTA，PMSF；将－20℃菌体破碎成2厘米以下的碎块；加入到裂解缓冲液（pH7.5）中，2℃～10℃下搅拌2hr；冻融使细胞完全破裂，释放干扰素。127

②

菌体预处理

向裂解液中加絮凝剂聚乙烯亚胺，2℃～10℃，气动搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。向裂解液中加凝聚剂醋酸钙溶液，2℃～10℃、气动搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀；在2℃～10℃下，将悬浮液在连续流离心机上16000r/min离心，收集含有重组干扰素蛋白质的上清液，细胞壁等杂质沉淀在121℃、30分钟蒸汽灭菌后焚烧处理。128

③初级分离将收集的上清液用4M硫酸铵进行盐析，2℃～10℃下搅匀静置过夜。

将盐析液在连续流离心机上于16000r/min离心，沉淀即为粗干扰素。放入聚乙烯瓶中，于4℃冰箱保存（不得超过3个月）。

129①使用保护剂硫二乙醇：干扰素中的巯基极易被氧化形成二硫键，使用巯基试剂加以保护。金属螯合剂EDTA：金属离子是酶的激活剂和辅助因子，加入金属螯合剂可除去金属离子，从而抑制酶的活性。

PMSF：PMSF（苯甲基磺酰氟）是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，加入可保护目标产物以免被水解。（2）干扰素分离工艺过程控制130加入聚乙烯亚胺产生絮凝作用。较低浓度下增加絮凝剂用量有利于架桥作用，提高絮凝效果；絮凝剂用量过多会吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作用，造成胶粒再次稳定，降低絮凝效果；过量絮凝剂将核酸包围，无法实现大范围搭桥作用的沉淀，同时包裹一些目标产物，造成损失。高剪切力打碎絮团，因此适当的搅拌时间和速度可提高絮凝效果。加入絮凝剂时，注意不要使溶液局部絮凝剂的浓度过高，浓度过高会削弱沉淀的作用。②使用絮凝剂131

。

③使用凝聚剂加入醋酸钙产生凝聚作用。菌体及其碎片大多带负电，由于静电引力作用将溶液中的带正电的粒子吸附在周围，形成双电层的结构，水化作用是胶体稳定存在的一个重要原因。加入醋酸钙的作用是破坏双电层和水化层，使粒子间的静电排斥力不足以抵抗范德华力而聚集起来。132（3）干扰素纯化工艺过程

①溶解粗干扰素超纯水配制纯化缓冲液（pH7.5磷酸缓冲液），0.45μm滤器和10ku超滤系统过滤，百级层流下收集。超滤后将缓冲液送到冷室，冷却至2℃～10℃。使用前检查:缓冲液的pH值和电导值。在2℃～10℃下将粗干扰素倒入匀浆器中，加pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。133②

沉淀与疏水层析粗干扰素完全溶解后，用磷酸调溶液调节至pH5.0，进行蛋白质等电点沉淀。将悬浮液在连续流离心机上16000r/min离心，收集上清液。用NaOH调节上清液pH7.0，并用NaCl调节溶液电导值，上样，进行疏水层析，利用干扰素的疏水性进行吸附。2℃～10℃下，用磷酸缓冲液（pH7.0）＋NaCl进行冲洗，除去非疏水性蛋白，然后用磷酸缓冲液（pH8.0）洗脱，收集洗脱液。134

③沉淀与透析除盐用磷酸调节洗脱液pH4.5，调节洗脱液的电导值，搅拌均匀后，2℃～10℃下静置过夜，进行等电点沉淀。沉淀悬浮液用1000ku的超滤膜进行过滤，除去大蛋白。在2℃～10℃下收集滤液。调整溶液pH8.0，电导值5.0mS/cm，在10ku超滤膜上，在2℃～10℃下，用缓冲液透析。

135④阴离子交换层析与浓缩

上样前，先用0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。上样后，相同缓冲液洗涤。2℃～10℃下，采用盐浓度线性梯度5～50mS/cm进行洗脱，配合SDS收集干扰素峰。合并阴离子交换层析洗脱的有效部分，调整溶液pH值5.0，电导5.0mS/cm，10ku超滤膜，在2℃～10℃下，用醋酸缓冲液（pH5.0）进行透析。

136⑤

阳离子交换层析与浓缩上样前，先用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样后，相同缓冲液洗涤。在2℃～10℃下，采用盐浓度线性梯度进行洗脱，配合SDS收集干扰素峰。合并阳离子交换层析洗脱的有效部分，在2℃～10℃下，用10ku超滤膜进行浓缩。浓缩到1L。

137⑥凝胶过滤层析上样前，先用含有NaCl的磷酸缓冲液（pH7