工艺学-发酵相关知识补充-灭菌技术

第二章灭菌技术第一节培养基灭菌第二节空气过滤除菌一、常用的灭菌方法(一)化学物质灭菌

1.原理：与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物

2.常用化学消毒剂甲醛（福尔马林），主要是气体杀菌，常用于染菌罐的处理和发酵厂房内部环境的定期消毒灭菌，10mL/M3。乙醇，70％，皮肤消毒用，浓度过高会在菌体表面形成膜，影响乙醇进入菌体。石炭酸，2％～5％溶液，用于器械和环境的喷雾消毒。来苏尔，2％，较石炭酸刺激性小，用于皮肤消毒。新洁尔灭，由5％原液稀释至0.25％水溶液采用杀菌作用，用于无菌室的喷雾消毒和皮肤，器械的表面消毒。漂白粉，配成10％的水溶液，用于环境及发酵车间内的下水道、地沟等污染地段的消毒。3.适用范围：只适合于无菌室或实验室的净化消毒灭菌，或用于发酵车间的环境消毒灭菌，而不能用于发酵工业生产设备和物料的消毒灭菌。(二)干热灭菌法1.利用火焰和热空气进行灭菌的方法。2.电热烘箱，在150～170℃下维持1～2小时，细胞成分发生氧化、细胞蛋白质变性、电解质浓缩等效，其中导致微生物死亡的主要作用是氧化。适用于工业要求为灭菌后能保持干燥状态物料的灭菌，棉塞，金属制品，玻璃器皿等。3.灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、针、钩，试管口，三角瓶口等少数对象的灭菌。种子罐（小型罐）接种时火焰保护开口接种。4.虽简单有效，但不能用于发酵生产的消毒灭菌。表4-1干热灭菌温度和时间的关系

灭菌温度/（℃）灭菌时间/（min）17060160120150150140180121过夜(三)湿热灭菌法湿热灭菌是直接用饱和蒸汽进行灭菌。（1）为何在相同温度下湿热比干热灭菌效果好？①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。(蛋白质或酶的热失活与水的关系，水引起酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用，天冬氨酸肽键的水解，二硫键的破坏，半胱氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化）②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度。

发酵工业中处理大量培养基时广泛采用湿热灭菌。1.湿热灭菌概述2.影响培养基灭菌的因素

（1）pH值的影响

pH值对微生物的耐热性影响很大，pH为6.0～8.0时微生物最不易死亡，pH<6.0时氢离子易渗入微生物的细胞内。

（2）培养基成分

①油脂、糖类、蛋白质，尤其是蛋白质，凝固在菌体表面形成膜，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。②高糖、高氮、高浓度的丰富培养基（培养基基础料和中间补料）既要考虑营养不被破坏，又要考虑灭菌的难度，如玉米浆、麸质粉本身含有大量的蛋白质且寄生大量杂菌，尤其是芽孢杆菌。实消，加热升温40min,控制125℃，0.12MPa，保温30min。③易挥发物料，如尿素，硫酸铵等，本身较纯净，高温破坏本身成分，较低温度，压力和较短时间为宜。实消，加热升温20min,控制105℃～110℃，0.05MPa，保温10min足够。④一般葡萄糖，淀粉，无机盐，较纯净，易于消透，实消，加热升温40min,控制120℃，0.10～0.12MPa，保温20min。⑤高浓度的盐类，色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。（3）培养基中的颗粒物质

培养基中的颗粒物质大，灭菌困难，反之，灭菌容易。一般说来，含有颗粒对培养基灭菌影响不大，但在培养基混有较大颗粒，特别是存在凝结成团的胶体时，会影响灭菌效果，必须过滤除去。

（4）泡沫

泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难以穿透过去杀灭微生物。加入消泡剂。（5）蒸汽的质量与压力①湿饱和蒸汽。蒸汽中带有一定的水份，混悬无数微细水滴，由蒸汽输送管路中热量损失造成，此时蒸汽热含量较低，穿透能力较差，灭菌效果较差。②饱和蒸汽。蒸汽温度与水的沸点想当，当蒸汽的压力达到平衡时，蒸汽中不含有细微水滴，热含量高（潜热），穿透能力较大，灭菌效果较好。③过热蒸汽。蒸汽中的液态的水完全蒸发后，再继续加热即成为过热蒸汽。与干热状态相似，在压力不变，温度继续上升的情况下，蒸汽温度虽然比饱和蒸汽高，但穿透力差，灭菌效果不如饱和蒸汽。二、生产上培养基的灭菌方法1.概念：

将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程。

（一）分批灭菌（实罐灭菌，实消）2.分批灭菌的一般操作过程（1）培养基预热

培养基先加热到80～90℃，然后再导入蒸汽升温到120～180℃。

①预热的目的？②预热的方法？（2）培养基灭菌

方法：将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内，所谓的“三路进气”。使罐温上升到120～130℃，罐压维持在1×l05Pa(表压)左右，并保温30min。3.分批灭菌的注意事项（1）各路进口要蒸汽畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。（2）排气量不宜过大，以节约蒸汽用量。（3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却。（4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于空气过滤器压力。（5）要考虑物料体积对升温过程的影响。（6）空罐的准备①发酵罐空罐严密度的检查往往被忽略，但教训深刻。②罐内、罐外设备的检查搅拌传动系统、罐内管路、冷却设备蛇管和夹层罐外各管路、支管路、阀门的严密度及畅通情况

取样阀门被菌丝焦化物堵塞倒罐的教训。③死角的清除死角指的是在灭菌过程中蒸汽的高温所达不到、消不透的角落。④空罐的预消有些厂家。（7）原材料中颗粒及杂物的干扰（8）搅拌在实罐灭菌中的作用（9）加热和保温

间接加热升温直接进汽（10）假压力的形成与防止（11）泡沫的产生与消除（7）原材料中颗粒及杂物的干扰（8）搅拌在实罐灭菌中的作用（二）连续灭菌

1.概念：

将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。

2.连续灭菌流程(1)配料（2）预热预热的目的可不预热（3）加热加热的主要作用？温度l26～132℃；停留时间20～30s

不同的加热器料液进口（4）保温杀灭微生物的主要过程

A.维持罐

B.罐式维持器避免返混，减少培养基成分破坏

喷淋冷却器（5）降温

A.喷淋冷却器

B.螺旋板换热器

C.板式换热器

D.真空冷却器板式换热器连消塔式连续灭菌流程喷射加热式连续灭菌流程板式换热式连续灭菌流程

3.空罐灭菌空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过连续灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。

4.发酵附属设备及管路的灭菌

发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。物料总管路的准备与灭菌管道灭菌的蒸汽压力不应低于3.4×l05Pa(表压)，灭菌时间为1h。新安装的管道或长期未使用的管道灭菌时间可延长到1.5h，灭菌后以无菌空气保压，自然冷却。分批灭菌和连续灭菌的比较连续灭菌的优点：高温瞬时，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小连续灭菌不适宜的情况培养基中含有颗粒或较多泡沫容积较小的发酵罐其他灭菌方法1.巴氏消毒法（pasteurization）用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它们的风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法。2.低温维持法：在63℃下保持30分钟可进行牛奶消毒；3.高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保持15秒钟即可。4.丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮15～60分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。常规加压灭菌法盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至121℃（压力为1kgf／cm2或15磅／英寸2），时间维持15～20分钟，也可采用在较低的温度（115℃，即0.7kgf／cm2或10磅／英寸2）下维持35分钟的方法。（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止

消除高温有害影响的措施（1）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；（2）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（3）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸2下灭菌15分钟）；（4）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌（5）过滤除菌过滤除菌法

是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。纯生啤酒生产过程中，用微孔滤膜代替高温瞬时杀菌和巴氏杀菌。采用微孔滤膜滤器除菌的关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。固体培养基的灭菌

固体培养基的灭菌一般称为蒸料，蒸料是目前固态发酵酿造酱油和食醋中用得最广的一种方法。

蒸料的目的①粉碎后的淀粉质原料吸水后膨胀，借助于蒸煮时的高温高压作用，使植物组织和细胞破裂，细胞中淀粉释放出来，淀粉由颗粒状态转变为溶胶状态（即原料中的淀粉达到糊化程度），并产生少量糖类供米曲霉生长利用。②使原料中的蛋白质达到适度变性，易于被米曲霉发育生长所利用，并为以后酶分解提供基础。③对原料进行灭菌。第二节空气除菌

空气中微生物的分布

空气中微生物的存在形式：一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103～104个／米3。北方气候寒冷干燥，空气中的含菌量较多；离地面越高，含菌量越少，一般每升高10米，空气中的含菌量就降低一个数量级；城市的空气中含菌量较多，农村的空气中含菌量较少，一般城市空气中杂菌数为3000～8000个／米3

空气中的微生物以细菌和细菌芽胞较多，也有酵母，霉菌和病毒。无菌空气的标准只要除去0.3～0.5μm的微粒，就可认为是无菌

发酵对空气无菌程度的要求

好气性发酵需要大量无菌空气，空气要作到绝对无菌很困难，也不经济。发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3

一、空气除菌的方法

（一）辐射杀菌（二）热杀菌

（三）静电除菌（四）过滤除菌（一）辐射灭菌法

最常用的是紫外线无菌室灭菌，无法满足工业化生产的需求。（二）热灭菌热空气进入培养系统之前，一般均需用压缩机压缩，提高压力。空气压缩后温度能达到200度以上，保持一定时间后，便可实行干热杀菌。利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌的原理对制备大量无菌空气有特别意义。实际应用中需考虑培养装置与空气压缩机的相对位置，连接压缩机与培养装置的管道的灭菌以及管道长度等。（三）静电除菌静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘埃，同时也除去微生物。原理：利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的。对于一些直径小的微粒，所带电荷小，不能被吸附而沉降。（四）介质过滤除菌

过滤介质按孔隙的大小可分成两大类，一类是介质间孔隙大于微生物，故必须有一定厚度的介质滤层才能达到过滤除菌目的，称为介质深层过滤除菌；而另一类介质的孔隙小于细菌，含细菌等微生物的空气通过介质时，微生物就被截留于介质上而实现过滤除菌，称之为绝对过滤。介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发酵厂广泛采用的方法。二、介质深层过滤原理深层过滤所用的过滤介质—棉花的纤维直径一般为16～20微米。充填系数为8%时，棉花纤维所形成网格的孔隙为20～50微米，微粒大小为(0.5-2微米)。微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流前进，使气流出现无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进；这些改变引起微粒以对滤层纤维产生惯性冲击、阻拦、重力沉降、布朗扩散、静电吸引等作用而把微粒滞留在纤维表面上。１．惯性碰撞截留空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞截留。惯性冲击捕集效率η-单纤维的惯性冲击捕集效率

b-纤维能滞留微粒的宽度区间(m)df-纤维直径（m）

截留区域b的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，对于特定的微粒，气流速度愈大，惯性力大，截留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。空气流速V0称为惯性碰撞的临界速度。临界速度随纤维直径和微粒直径而变化。２拦截滞留当气流速度下降到临界速度以下时，微粒就不能因惯性碰撞而滞留于纤维上，捕集效率显著下降。但实践证明，随着气流速度的继续下降，纤维对微粒的捕集效率不再下降，反而又有所回升.当气流在滞流状态下夹带微粒慢慢靠近介质时，主导气流流向受纤维所阻而改变流动方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞流区，区内的气流速度更慢。滞留区的微粒渐渐靠近和接触纤维而被粘附滞流，称为拦截滞留作用。截留作用的捕集效率决定于微粒直径和纤维直径之比，又与空气流速成反比，当气流速度低时截留才起作用。空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。当气流速度更小时，直径细小的细菌在气流中能产生一种不规则的直线运动，称为布朗扩散运动。当细菌与纤维介质接触时就附着于纤维表面而被捕集。布朗扩散的运动距离很短，在较大的气流速度或较大的纤维间隙中布朗扩散作用很小，可忽略不计。但在很小的气流速度或较小的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触滞留机会。布朗扩散作用捕集效率与微粒和纤维直径有关，并与流速成反比，在气流速度小时，它是介质过滤除菌的重要作用之一。只有在气流速度较低时才较显著。3.布朗扩散运动４、重力沉降作用机理重力沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。

５、静电吸附作用机理干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子20%带正电荷，20%带负电荷，15%中性，这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。总之，通过实践认识到，当空气流过介质表面时，上述五种机理—惯性撞击、截留、扩散、重力沉降和静电吸附同时都起作用，不过气流速度不同，起主要作用的机理也就不同。当气流速度很大时，除菌效率随空气流速的增加而增加，此时，惯性撞击起主要作用；当气流速度较小时，除菌效率随气流速度的增加而降低，此时，扩散起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留和重力沉降起主要作用。如果空气流速巨大，除菌效率反而下降，则是由于已被捕集的微粒又返回到气流中。三、过滤介质与过滤器１、棉花２、玻璃纤维３、活性炭４、超细玻璃纤维纸５、石棉滤板６、烧结材料过滤介质７、新型过滤介质（一）过滤介质影响介质过滤效率的因素介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。对于相同介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流量有关。1.纤维介质深层过滤器过滤器的有效过滤介质厚度L的决定，通常在实验数据的基础上，按对数穿透定律进行计算。填充物按下面顺序安装：孔板→铁丝网→麻布→棉花→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板。（二）过滤器2.平板式纤维纸过滤器3.管式过滤器过滤器失效压缩空气进入过滤器后便引起活性炭颗粒之间相互顶撞与摩擦，久而成为粉末(灰化)，活性炭的体积也逐渐变小，于是过滤器内的空间逐渐增大，到达-定程度时，便会发生棉花成90°翻身现象。这样空气便会未经过滤而进入罐内，引起染菌。棉花经过多次加热灭菌后，颜色逐渐变深，靠近过滤器壁的棉花，因经受夹层蒸汽的烤干，受热更为剧烈，更容易变