DB1709-2018牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术

ICS65.020.30B43

DB63青 海 省 地 方 标 准DB63/T1709—2018牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程2018-12-26发布 2019-03-20实施青海省市场监督管理局 发布DB63/T1709DB63/T1709—2018II前 言本标准依据GB/T1.1—2009的规则编写。本标准由青海省农牧业标准化专业技术委员会提出并归口。本标准起草单位：青海省畜牧兽医科学院。本标准主要起草人：徐惊涛、孙永刚、李瑞哲。DB63/T1709DB63/T1709—2018PAGEPAGE4牦牛胚胎快速冷冻保存及解冻技术操作规程范围本标准规定了牦牛胚胎快速冷冻和解冻的操作方法。本标准适用于牦牛胚胎生产技术推广应用的规范化操作。规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T25881牛胚胎GB/T26938 牛胚胎生产技术规程NY/T1572牛胚胎移植技术规程DB63/T1163牦牛体外受精胚胎生产技术操作规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牦牛胚胎 yakembryo通过自然交配、人工授精、体外受精等方式产生的牦牛早期受精卵（受精后6d～8d）。3.2胚胎快速冷冻 embryorapidcryopreservation经过清洗、胚胎冷冻保护剂平衡后，将胚胎直接置入液氮中保存的一种冷冻方法。3.3胚胎解冻thawingoffrozenembryo将冷冻保存的胚胎按照操作程序融化，去除冷冻保护剂，使胚胎恢复活性的过程。试剂、耗材、设备和实验室要求试剂、耗材和设备所用的试剂、耗材和设备以及要求见附录A。实验室要求冷冻保存液、解冻液及移植液必须在符合GB19489相关条款的实验室中配制。器具清洗、消毒所用器具的清洗、消毒见附录B。试剂配制及保存试剂配制用水试剂配制用水按照GB/T6682中的分级标准采用一级水。冷冻保存液基础液（BS）TCM-199中加入20%胎牛血清（FBS）。平衡液（ES）TCM-199中加入7.5%乙二醇（EG）、7.5%二甲基亚砜（DMSO）、20%胎牛血清（FBS）。冷冻液（VS）TCM-199中加入15%乙二醇（EG）、15%二甲基亚砜（DMSO）、0.5mol/L蔗糖（Su）、20%胎牛血清（FBS）。胚胎解冻液解冻液（TS）TCM-199中加入1.0mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。稀释液（DS）TCM-199中加入0.5mol/L蔗糖（Su）和20%胎牛血清（FBS）。PBS（m-PBS）改进PBS液（m-PBS）配制见附录C。胚胎移植液（TM）m-PBS中加入4mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和10%胎牛血清（FBS）。解冻后胚胎培养液TCM-199液中加入10%胎牛血清（FBS）和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。试剂保存基础液、平衡液、冷冻液、解冻液、胚胎移植液等试剂在无菌操作台中配制，配制后的试剂用0.22μm0℃～4℃冰箱或冷藏箱中保存。每次装、取液后，均须即时封闭试剂保存管管口。7d胚胎生产按照GB/T26938和DB63/T1163相关技术操作规程生产。胚胎冷冻及解冻前准备胚胎冷冻、解冻操作室18℃～25射，提前清理好环境卫生，对操作台用75%酒精进行消毒。操作人员卫生安全清洗双手并用75%酒精消毒，佩戴一次性口罩和手套，穿着消毒后的工作服，进行胚胎冷冻、解冻操作。冷冻、解冻前胚胎预备8镜下进行胚胎分拣和分类。10冷冻前胚胎分级GB/T25881ABCAB胚胎快速冷冻将装有基础液（BS）、平衡液（ES）、快速冷冻液（VS）20min。将适量液氮倒入泡沫箱中。在胚胎快速冷冻管和冷冻管包装袋（桶）育期、胚胎级别、存入时间等。35mm3BS、ES、VS，用移液器加入相应的液体3mL。ABBS32min～3minES23min。VS15s～20s40s（Cryotop）管片上，迅速浸入泡沫箱中的液氮中。在泡沫箱的液氮中用镊子将胚胎快速冷冻管管片端插入套管后，放入冷冻管保存袋（桶）冷冻管保存袋（桶）GB/T5458胚胎解冻20min。35mmTS、DS、BSTM，1mi