一株产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其生物特性研究

一株产!-氨基丁酸乳酸菌的筛选及其生物特性研究［摘要］本研究从陕西汉中泡菜汁中分离筛选出一株可产!-氨基丁酸（GABA）的乳酸菌P16,并对其生物特性进行了研究。结果表明：该菌株GABA的产量为0.796mg/mL;该菌株生长较快，培养2h进入对数生长期，12h后进入稳定期；菌株具有良好的耐酸性和耐盐性，在pH值达到2或NaCl浓度达到9%（W/V）时仍然可以存活，最适生长pH为6-7;菌株耐受胆盐的延迟时间可达0.94h。通过形态学观察和分子生物学鉴定，确定该菌株为短乳杆菌Lactobacillusbrevis，将其命名为LactobacillusbrevisP16）本研究为高产GABA乳酸菌发酵剂的开发和应用提供了理论依据。［关键词］乳酸菌；！-氨基丁酸；生物特性ScreeningforaLacticAcidBacteriaProducingy一Aminobutyric

AcidandStudyontheBiologicalPropertiesAbstract:Inthisstudy,alacticacidbacteriumP16thatcanproduce^一aminobutyricacid(GABA)wasisolatedandscreenedfrompicklejuiceinHanzhong,Shaanxi,anditsbiologicalcharacteristicswerestudied.TheresultsshowedthattheoutputofitsGABAis0.796mg/mL.Theresultsshowedthatthegrowthcycleofthestrainwasrelativelyshort,itenteredthelogarithmicgrowthphaseat2hours,andreachedstationaryphaseafter12hours.Thestrainhasgoodacidfastnessandsalttolerance.ItcouldgrowunderpH2and9%*aCl(W,6)conditions.TheoptimumpHandtemperatureforitsgrowthwas6-7.Thebiletoleranceofthisstrainintheformoflagtimewas0.94h.Throughmorphologicalobservationandmolecularbiologicalidentification,thestrainwasdeterminedtobeLactobacillusbrevis,anditwasnamedLactobacillusbrevisP16.Thisstudyprovidesatheoreticalbasisforthedevelopmentandapplicationofhigh-yieldGABAlacticacidbacteriastarter.Keywords：Lacticacidbacterium;GABA;Biologicalproperties!-氨基丁酸，可简称为GABA,又称为氨酪酸，是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸。在哺乳动物体内只存在于中枢神经系统，经谷氨酸脱羧酶催化由谷氨酸转化而成E,具有抗疲劳、降血压⑵、改善睡眠以及提高人体记忆力⑶等生理功能,是一种兼具药理作用和保健功能的新型功能因子，现已被国家卫生部批准为“新资源食品”，可用于巧克力、可可制品、糖果、饮料、膨化和焙烤食品中，在食品领域具有良好的应用前景。-ABA的制备方法主要包括植物富集法、化学合成法及微生物合成法三类，相比较而言，植物富集法产量低、成本高且难度大，化学合成法反应复杂且安全性差,而微生物发酵合成法成本低、安全性较好且条件温和，适用于大规模生产制备，是较为理想的合成方法乳酸菌是可利用糖类发酵产生乳酸的一类细菌统称,作为世界公认的食品安全级益生菌被广泛应用于泡菜和酸奶等发酵食品的生产制作，通常情况下泡菜汁中存在着大量乳酸菌。近年来，乳酸菌的有益作用越来越受到人们的关注，大量试验结果表明，乳酸菌具有促进肠道消化、降血压血糖"（'、提高人体免疫能力⑺、降低人体胆固醇囱和抗肿瘤等功能，不同种属的乳酸菌往往具有不同的益生功能®。目前，已有不少研究表明在酸奶、土壤、腌制酸菜等材料中发现了产GABA的乳酸菌株。如李远宏皿等人从鲜奶中筛选出一株高产-ABA的乳酸乳球菌，产量达到4.68g/L；曾小群〔⑵等从新疆酸马奶分离获得一株戊糖乳杆菌，产GABA量为1.6g/L；缪存影［13-14］等从酸菜中筛选获得一株产酸菌,静置发酵可得13.45g/L的GA-BA。本研究拟从陕西汉中泡菜汁中筛选能够高产！-氨基丁酸的乳酸菌,并对其进行生物特性的研究，以期为微生物发酵法生产制备GABA以及功能性乳酸菌的筛选分离等相关研究提供一定的参考价值。1材料与方法1.1材料与仪器泡菜汁来源于陕西汉中地区32家农户；GABA标准品西安晶博生物科技有限公司；L-谷氨酸、次氯酸钠、苯酚、四硼酸钠、茚三酮、正丁醇、冰醋酸等西安晶博生物科技有限公司。LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;SPX-2501-G型微电脑光照培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-1CV超净台苏州安泰空气技术有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计日本岛津;PHS-3CpH计上海精密科学仪器有限公司；HC-3018型高速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1产GABA乳酸菌的筛选和分离1） 样品菌株的活化:吸取1mL泡菜汁样品于5mLMRS液体培养基中，振荡混匀，在37u条件下活化24h。2） 乳酸菌的分离纯化及初步鉴定:吸取200-L活化后的样品溶液涂布于MRS固体培养基上，于37U培养48h。挑取生长状况较好的单菌落，在MRS平板上不断划线进而得到纯化菌株，放入37U恒温箱中培养48h,记录各菌落的形态特征，包括菌落的颜色、形状、大小、表面和边缘的性状等。通过革兰氏染色初步鉴定样品菌株是否为乳酸菌并记录菌株在显微镜下的形态,乳酸菌应为革兰氏阳性菌。3） 产酸菌株的筛选邱：由于产酸量大的菌株可以水解培养基中添加的碳酸钙，形成水解圈，因此可根据水解圈的大小来判断菌株的产酸能力。筛取产酸能力较强的菌作为进一步筛选的菌株。4） 产GABA乳酸菌的筛选直：将产酸能力较强的纯化菌株接种于5mLMRS液体培养基，在37U条件下活化培养24h。再按2%的接种量将其接种于20mL以L-谷氨酸为基质的液体发酵培养基中,37U恒温条件下静置发酵3天,取发酵液经纸层析定性分析及比色法定量测定后确定产GABA的菌株。GABA的定性分析采用纸层析法定性分析菌株发酵液中是否存在GABA,由此判断菌株是否产GABA）按冰醋酸:水:正丁醇=1:3:4的体积比配置展开剂，并添加0.4g/100mL的茚三酮作为显色剂。取适量GABA及L-谷氨酸制成浓度均为1mg/mL的2mL标准液，取2mL样品发酵液煮沸5min,按照12000r/min的转速离心5min,取上清液以甲醇定容至2mLo将定性滤纸裁剪成适当大小，用铅笔在离滤纸底边1.5cm处画一条直线，线上每隔1.5cm标记一个点作为点样位置。用移液枪分别吸取2-L标准液及样品液依次点样,将层析纸放入展开剂中层析2h,之后放入57U恒温干燥箱中干燥显色2+3h。以GABA和谷氨酸标品及无菌MES液体培养基发酵液作为对照，根据标准品的Ef值进行定性判断，从而确定产GABA的菌株。GABA的定量检测根据比色法定量测定产GABA菌株发酵液中的GABA含量。利用Berthelot反应，即苯酚、次氯酸钠与游离氨的反应呈蓝色来测定体系中的微量氨，通常GABA浓度越高，反应后溶液呈现的蓝色越深。1） GABA标准曲线的绘制：准确配制浓度分别为0,0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mg/mL的GABA标准溶液,分别取1mL标准液依次加入1mL浓度为0.01mol/L的四硼酸钠缓冲液、1mL浓度为6g/100mL的苯酚溶液以及2.5mL的7.5g/100mL次氯酸钠溶液，充分混匀后沸水浴10min,再冰浴5min,待溶液呈蓝绿色加入2mL60%乙醇溶液,630nm处测0D值，以吸光度（y）为纵坐标，各标准液质量浓度为横坐标（x,mg/mL）作图得标准曲线，并建立回归方程。2） 样品中GABA含量的测定:取5mL产GABA菌株的发酵液于5000r/min离心20min,取1mL上清液，按照前面的方法进行处理,630nm处测YD值，取等量无菌水为空白对照，根据标准曲线方程求得相应GABA含量。1.2.4菌株生物特性研究1）菌落菌体形态观察将产GABA的乳酸菌P16涂布于MES培养基上,37U培养48h后，观察其菌落形态特征。挑取单个菌落于载玻片上进行涂片、革兰氏染色，然后在显微镜下观察菌体形态。2） 菌株生长曲线的测定取对数生长期的菌株，按2%接种量接种于MES液体培养基中，于37U下培养24h,每隔2h取样一次,测定其菌液0D600nm值并绘制生长曲线。3） 菌株耐酸性的测定以1mol/LHCl溶液和1mol/LNaOH溶液调节MES液体培养基的pH值,分别为2.0*2.5*3.0*4.0*5.0*6.0*6.5和7.0,取对数生长期的P16菌株按2%的接种量接种，充分混匀，在37U恒温烘箱中培养20h,使用分光光度计于600nm波长下测定其OD值并绘制曲线。4） 菌株耐盐性的测定取对数生长期P16菌株以2%的接种量分别接种到NaCl（W/V）分别为0%*2%*4%*6%*7%*8%*9%的MES液体培养基中，振荡混匀,于37U下培养20h后测定OD600nm值。5） 菌株对胆盐的耐受能力测定取对数生长期的P16菌株，以2%的接种量分别接种于含有或不含0.3%胆盐的MES-THIO（MES含有0.2%的疏基乙酸钠）培养中，充分混合均匀，在37U下培养。记录培养基吸光值到达0.3个单位时各组所需的时间，不加胆盐与加了胆盐两组的时间差即为P16在胆盐中生长的延迟时间（LT），延迟时间的长短,反映了乳酸菌对胆盐的耐受能力。时间越短说明耐受胆盐的能力越强，反之则耐受胆盐的能力越弱。1.2.5菌株的分子生物学鉴定提取产GABA的P16菌株的DNA进行16srDNA基因的PCR扩增，用16S通用引物27f(AGAGTTT-GATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)对基因组进行PCR扩增，将扩增产物送至测序公司，测得的序列与数据库进行对比分析,由此鉴定菌株的种类。2结果与讨论2.1产GABA乳酸菌的筛选结果2.1.1产酸菌株筛选结果通过MRS培养基从32份泡菜汁样品中共分离出约40株菌,80%的泡菜汁中只分离出一株菌株，由此可判断泡菜汁中存在大量产酸菌株使得生长环境pH值较低，不利于其他菌株的生长。将40株菌放入添加CaCO%的MRS固体培养基培养后，依据培养基中碳酸钙水解圈的大小判断菌株产酸能力的强弱，由此得到14株产酸能力相对较强的菌株。2.1.2纸层析定性GABA结果取GABA和L-谷氨酸标准溶液以及产酸样品菌株的发酵液点样，取无菌发酵液为空白对照，其中GABA标品编号为a，L-谷氨酸标品编号为b,无菌发酵液为c,14株样品溶液编号为d~qo经纸层析定性分析，结果如图1所示。通过样品发酵液及标准溶液的Rf值对比，可判断标号为e的菌株P16产GABA较为明显。图1纸层析定性分析结果2.1.3比色法定量测定GABA结果1)GABA标准溶液曲线的绘制：由图2可得，GABA标品溶液曲线的线性回归方程为y=0.4521a-0.0229,相关系数R2=0.9912,精确度较高，因此可根据该方程计算样品发酵液中GABA的含量。y=0.4521xy=0.4521x-0.0229R2=0.9912GABA标准溶液浓度(mg/mL)图2GABA标准溶液曲线(OD630nm)2)样品中GABA含量的测定:将菌株P16发酵液处理后于630nm波长处

测得OD值为0.337,代入线性方程中，得出样品发酵液中GABA含量为0.796mg/mL。2.2菌株P16的生物特性研究2.2.1菌落菌体形态将产酸菌株P16于MRS平板上通过划线分离纯化,37U厌氧培养48h,菌株生长良好。其菌落形态如图3A所示，菌落呈乳白色,不透明，形状为较为规则的圆形，表面光滑,菌落直径约为2mm,边缘齐整。菌体特征如图3B所示，菌体杆状，不产孢子，无运动性，革兰氏阳性菌,显微镜下为短杆状。图3菌株P16的菌落形态与菌体形态2.2.2菌株P16的生长曲线图4菌株P16的生长曲线如图4所示，菌株P16在2h时开始进入对数生长期，培养10h后到达稳定期，活菌数可达到108CFU/mL。.3菌株P16的耐酸能力图5pH值对菌株P16生长的影响pH值对菌株P16的影响见图5。研究表明，该菌株生长最适pH范围6.0-7.0,在pH=2.0时的酸性环境下仍可生长,由此可判断该菌具有良好的耐酸性。2.2.4菌株P16对NaCl的耐受能力图6NaCl对菌株P16生长的影响NaCl对菌株P16的影响如图6）研究表明，菌株P16对NaCl的耐受能力较好，在NaCl