中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的研究

1、中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的研究【摘要】目的考察中性蛋白复合酶法提取大枣多糖的工艺，并验证大枣多糖的局部药理作用。方法对不同提取方法作比照；以多糖的得率和纯度为指标，对效果较佳的中性蛋白复合酶提法安排正交实验，挑选提取工艺；最后进展动物实验。结果确定中性蛋白复合酶法提取的最正确工艺为：酶液浓度0.15%，pH7.5，提取温度37；大枣多糖的药理实验说明大枣多糖属无毒级，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨噬细胞吞噬率均有不同程度的进步作用。结论中性蛋白复合酶法提取大枣多糖工艺有效可行。【关键词】大枣多糖；中性蛋白复合酶；提取；药理实验Abstrat：bjetiveTstudytheextr

2、atintehnlgyfrplysaharidebypundneutralprteasefrZiziphusjujuba,andttestthepharalgialfuntinftheplysaharide.ethdsDifferentethdsfplysaharideextratinerepared.Asfrthebestethd,thepundneutralprteaseextratin,therthgnalexperientsereestablishedthuntitstehnlgy.Finally,thepharalgialexperientserearriedut.ResultsTh

3、eptiunditinseretadd0.15%neutralprteasenthepHf7.5ith37.TheultiatepharalgiexperientsabutZizyphusjujubaplysaharideshedthatithadntxiityandituldelevatethearphagephagytsisfS180turie.nlusinTheayfthepundneutralprteaseextratiniseffetiveandreasnable.Keyrds：Jujubaplysaharide;pundneutralprtease;Extratin;Pharalg

4、yexperient大枣为鼠李科植物枣Zizyphusjujubaill的成熟果实1，营养丰富，是传统的中药，其主要成分有多糖，蛋白质，氨基酸，维生素，生物碱，皂苷及矿物质等2。多糖能进步机体的免疫功能，是理想的免疫增强剂，同时对正常细胞没有毒副作用3。从大枣中提取多糖及其药理作用研究已有文献报道4，5。传统高温水提法易造成大枣多糖的生物活性降低，而且能耗大；溶剂萃取法那么存在溶剂使用本钱高，回收困难及产品溶剂残留等问题。大多数含有丰富多糖的植物，细胞粗大且壁厚，使得多糖难以从细胞中扩散出来，采用复合酶协同作用于植物提取过程，可以促进多糖的溶出，过程条件温和，目的产物活性高，极大地进步多糖的提

5、取率以及纯度6。大枣中的蛋白质对大枣多糖的提取别离造成一定的影响，大枣多糖普遍存在于原生质中，而原生质又处于细胞壁和细胞间质的包裹下，鉴于这些特点，假设选用含有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶的复合酶液来参与反响，就可以减少传质阻力，进步有效成分的提取率。1器材与方法1.1材料大枣购于陕北延安市场，选用质地优良的干品粉碎。1.2试剂中性蛋白复合酶液，酶活2500ug-1，酶液中含有少量纤维素酶、淀粉酶，由宁夏夏盛实业集团提供。1.3仪器DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂；LD4-2低速离心机：北京低速离心机厂；722型可见光分光光度计：上海第三分析仪器厂；HI98107酸碱度

6、测试笔：美国哈纳仪器公司；RE-52AA旋转蒸发仪器：上海嘉鹏科技公司；DZF-6020型真空枯燥箱：上海精宏实验设备。1.4分析方法多糖检测方法为苯酚硫酸法；数据处理法为加权平均法。2结果2.1不同提取方法的比照因为不同溶剂对大枣实体及其多糖的作用不同，所以用不同溶剂进展提取具有不同的结果。定量称取烘干枣粉20g,采用添加总质量浓度1%果胶酶复合液pH为7，纤维素复合酶液pH为7，中性蛋白复合酶液pH为7，40下提取2h，共进展两次提取，并以传统水提法为参照，确立最正确提取方法，结果见表1。表1不同提取液的提取结果略由提取结果可看出，果胶复合酶，纤维素复合酶参与提取与传统水提相比效果不是很显

7、著，果胶酶得到较好的得率，但纯度反而下降，就是因为果胶酶在水解大枣中果胶质的同时又进而水解掉一局部多糖。而纤维素酶那么在水解大枣纤维素使其构造变得松散的同时又直接将大枣中的糖蛋白和蛋白聚糖水解掉，直接导致得率下降。因此在大枣多糖提取中主要应用以上两种酶时并不能到达预期效果。中性蛋白复合酶参与提取效果显著，主要是因为中性蛋白酶对大枣中的游离蛋白质具有水解作用，且目的性强。鉴于上结果，本研究采用中性蛋白复合酶作为大枣多糖的提取剂。2.2中性蛋白复合酶最正确提取条件正交实验称取烘干枣粉20g共9份，按正交设计表条件进展提取，提取液浓缩13，体积分数80%醇沉，低温灭酶后，二次单纯采用去离子水提取2h

8、，得多糖用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，真空枯燥。利用正交实验对酶添加量、pH、温度等因素进展考察。实验因素程度见表2，最正确提取条件正交实验结果见表3。由极差结果得，3个因素对大枣多糖中性蛋白复合酶法提取的影响顺序为：BA，由实验结果确立主要影响因素参数为B32A3，即最正确提取条件为：中性蛋白酶对底物质量浓度0.15%，加酶温度37，反响pH值7.5。表2正交实验因素程度略表3中性蛋白复合酶最正确提取条件正交实验结果略2.3大枣多糖的药理实验取实验最正确工艺所得大枣多糖，经精制沉淀后，用于以下药理实验。2.3.1大枣多糖急性毒性实验取IR品系小鼠40只，雌雄各半，分为两大组；A组20只，B

9、组20只，给予B组灌胃大枣多糖药物以生理盐水稀释，最大质量浓度45%。每20g体重灌胃0.4l，每隔4h重复1次，共3次，观察动物死亡数和死亡时间。给与A组灌胃等剂量生理盐水。结果未见动物死亡，亦未见动物有其他反响。说明动物最大耐受量在27.0gkg-1以上，相当于原生药675gkg-1，属无毒级。2.3.2大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响取IR品系小鼠50只。将接种7d的S180实体瘤腹水型小鼠，消毒腹部皮肤，断头处死，抽取腹水，稀释3倍后，接种于各小鼠左侧腋下，皮下接种，每只0.2l。接种后第2天，称重，按体重分层随即将小鼠分为A，B，D，E5组，A组为S180实体瘤对照

10、组，B，D组分别为大、中、小剂量大枣多糖组，E组为环磷酰胺组。分组后开场给药，A组以生理盐水灌胃，B，D组分别按剂量为675，225和75gkg-1的大枣多糖药液灌胃；E组灌胃剂量为每只0.6g30gkg-1。以上各组均连续用药7d。于第7天前72h腹腔注射0.5%无菌淀粉盐水0.1l/只，于第7天再注射淀粉溶液1次，1h后腹腔注射0.5%鸡红细胞0.1l/只，6h后脱臼处死小鼠，取腹腔液涂片染色镜检。油镜下计数200个巨噬细胞，观察吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数目。结果以吞噬率表示。结果见表4。表4大枣多糖对S180实体瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响略结果说明，大枣多糖大、中、小剂量对S180小鼠巨

11、噬细胞吞噬率均有不同程度的进步作用，其中大、中剂量组有显著作用，有效剂量为225gkg-1，小剂量组进步不明显。3讨论纯酶自身本钱较高，酶的介入会直接增加大枣多糖提取的本钱费用，而这种复合粗酶使用本钱较低，其中还含有少量的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、这些酶互相之间可以产生协同作用，无疑对大枣多糖的提取非常有利。其中的主要成分中性蛋白酶主要可以使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解掉，那么，原有的除蛋白工艺步骤可以省略，进而简化了提取工艺，同时也可以到达一个较好的提取效果。【参考文献】1中国医学院药物研究所.中药志，第3册.北京:人民卫生出版社,1993:135.2李淑子,张本.大枣的化学和药理研究概况J.中草药,1983,1410：39.3冉靓,杨晓声,王伯初,等.抗氧化多糖的研究进展J.时珍国医国药，2022,174:494.4王健,龚兴国.多糖的抗肿瘤及免