质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用

1、质粒提取试剂盒中各溶液配方及作用溶液I(P1)组分浓度 25 mM Tris-HCl (pH8.0), 10 mM EDTA, 50 mM 葡萄糖(Glucose)溶液I组分主要作用是将菌体沉淀悬浮起来组分类型组分作用25 mM Tris-HCl (pH8.0)缓冲液保证反应体系的pH恒定10 mM EDTA金属离子螯合剂与微生物体内的金属离子相互结合，抑制 DNase的活性50 mM葡萄糖/增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体 沉降的时间RNA 酶(RNase A)酶降解掉溶液中的RNA备注：溶液I在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），由于RNA酶属于蛋白质，蛋 白质稳定性很差，所

2、以加了 RNase A的溶液I需要低温4C保存。二溶液II（P2）组分浓度250 mM NaOH, 1%（W/V） SDS （十二烷基硫酸钠）。溶液II组分主要作用是细胞裂解组分类型组分作用250 mM NaOH/氢氧化钠会破坏细胞膜的结构，使之发生bilayer （双层膜） 结构向micelle （微囊）结构的相变化，从而导致细胞的裂 解。1%（W/V）SDS （十二烷 基硫酸钠）/十二烷基硫酸钠（SDS）很容易与蛋白质结合，平均两个氨基 酸就会结合一个SDS分子，二者结合会形成SDS2多肽复合 体，这样变性蛋白质将溶解在溶液中，从而使得多肽链更好 地与基因组DNA缠绕。备注：（1）时间一定

3、不能过长；（2）不可以剧烈震动离心管。时间过长以及剧烈震动都将导致氢氧化钠破坏基因组DNA，断裂的基因组DNA碎片将会与相似大小质粒一同被抽提，污染样品。三溶液m（N3）组分浓度3M 醋酸钾（potassium acetate）， 5M 醋酸。溶液m组分主要作用：（1）中和第二步加入的强碱；（2）清除掉蛋白质等细胞内的杂质。组分类型组分作用5M醋酸/中和氢氧化钠3M醋酸钾/十二烷基硫酸盐与变性蛋白质结合成复合体，十二烷基硫酸钾 的沉淀就将变性的蛋白质一起沉淀，同时变性的蛋白质与基因 组DNA缠绕，结果也大部分被共沉淀了。而高离子浓度的溶 液又加速了这一沉淀过程。此外，溶液被中和后变性蛋白质表

4、面电荷减少，也可以促进变性蛋白质沉淀。备注：（1）强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA接触会破坏其结构，因此需要进行中和。四 溶液 PE (wash buffer)组分浓度 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 % 乙醇(Ethanol)wash buffer主要作用：清洗掉多余的盐离子备注：试剂盒中都是利用硅胶柱进行DNA提取的。在DNA与硅胶柱吸附后，需要利 用Wash buffer清洗掉多余的盐离子。Wash buffer中含有高浓度的乙醇，由于乙醇会影响后 续的酶切或测序反应，在洗脱DNA前必须要在离心机内”空甩”柱子，完全清除掉乙醇。五 溶液 EB（Elution buffer）组分浓度 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）Elution buffer洗脱硅胶柱上的DNA样品备注：（1） Elution buffer中不能含有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离 子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电的DNA 分子。（2）加热过的洗脱液（50 C）可以加速