第2节基因工程的基本操作程序课件

1、第2节基因工程的基本操作程序第2节基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关

2、的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：2获取目1. 从基因文库中获取目的基因1. 基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2. 基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库3.基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。1. 从基因文库中获取目的基因1. 基因文库

3、的概念:将含有某基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DN基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子启动子原核真核基因的结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合

4、位点:基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非

5、编码思考原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区基因文库的构建方法 基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存基因文库的构建方法 基因组文库的构建提取某种生物的全部DN cDNA文库的构建-逆转录法： 提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链DNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法： 提取某种生物的某思考？真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？思考？真核生物的基因用逆转录法得到的

6、真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNA双链DNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段） 基因多少 物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型 2.利用PCR技术扩增目

7、的基因1概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：2原理：DNA复制多聚第2节基因工程的基本操作程序PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一

8、次，目的基因增加_倍一PCR技术的操作过程a、DNA变性（90-95）：双链DPCR技术的操作过程PCR技术的操作过程PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶

9、、解旋酶等PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理3. 人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？3. 人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成人工合成法（真核生物）反转录法目的基因的信使RNA目的基因化课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用

10、PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库课堂小结目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建 基因工程的核心1目的：2基因表达表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的

11、一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来表达载体启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是R基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口DNA注意：载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键

12、都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意：载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部 三、将目的基因导入受体细胞1转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。3目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 三、将目的基因导入受体细胞1转化：2常用的受体细胞：3目的1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 原理：Ti质粒

13、上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。1、目的基因导入植物细胞的方法（1）农杆菌转化法 农杆三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导入稳定维持和表达过程：三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体转入农杆菌植物细胞导1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。 适用：单子叶植物1、目的基因导入植物细胞的方法（2）基因枪法：目的基因导入单1、目的基因

14、导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点:十分简便经济。 例：转基因抗虫棉1、目的基因导入植物细胞的方法（3）花粉管通道法：将目的基因2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序目的基因表3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：C

15、a2+处理大肠杆菌感受态 细胞感受态细胞 吸收DNA表达载体与感受态细胞混合3、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因：Ca2+小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子小结：将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细 四、目的基因的检测与

16、鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？ 不一定，需要检测 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄1、鉴定分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法DNA分子杂交技术变性变性1、鉴定分子水平的鉴定转基因生探针15N15N14N141、鉴定分子水平的鉴定变性方法分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N

17、14N1、鉴定分子水平的鉴定变性方法分子杂交技术（2）检测1、鉴定分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养1、鉴定分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验思考？不能，受体细胞必须表现出特定的性状，

18、才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？思考？不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是( )A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.D课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是( )D课堂练习3、有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合