生物制药工艺学氨基糖苷类抗生素讲义

1、第三节 氨基糖苷类抗生素教学目标：了解链霉素等抗生素的生产菌种、发酵工艺及操作要点和提取精制方法；掌握离子交换树脂法提取链霉素的原理。教学基本内容：氨基糖苷类抗生素概述氨基糖苷类（aminoglycosides ）抗生素是指抗生素分子中含有氨基糖苷结构的一大类抗生素。其化学结构都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷。又称 氨基糖苷氨基环醇类抗生素。氨基糖苷类抗生素的分类氨基糖苷类抗生素，按其分子基本结构可分为下列三组：链霉胺衍生物2- 去氧链霉胺衍生物其它氨基环醇类衍生物氨基糖苷类抗生素的理化性质氨基糖苷类抗生素一般为白色或微带黄色的结晶或粉末，易溶于水，在有机溶剂中微溶或不溶。氨基糖苷类抗生素的

2、化学反应（1）成盐反应此类抗生素一般能与无机酸和有机酸形成盐。无机酸盐易溶于水，不溶或难溶于有机溶剂。有机酸盐则反之。（2）水解反应经温和水解，可生成配糖体和二糖胺，二糖胺水解形成氨基糖和糖。（3）呈色反应这些抗生素在浓硫酸的作用下，形成糖醛或其衍生物，与a -蔡酚起紫色反应。含有氨基葡萄糖的抗生素，在碱性溶液中与乙酰丙酮共热 后，再与对二甲氨基苯甲醛反应，会生成玫瑰红色化合物。发展概况链霉素是瓦克斯曼（Waksman S A）于1944年发现的第一个氨基糖甘类抗 生素。 以后又陆续发现了新霉素（ neomycin） 、 卡那霉素 （ kanamycin） 和庆大霉素 （ gentamicin

3、 ） 等。 据不完全统计，至今已经发现的天然氨基糖苷类抗生素上百种以上，如果包括半合成的和微生物转化的新抗生素，以及衍生物，累计不 下数千种。作用机制细菌蛋白质的合成是通过核糖体及某些细胞质蛋白的催化来达到的。氨基环醇类抗生素抑制蛋白质合成起始过程的位点。如链霉素对蛋白质合成的起始、延长、中止各阶段均有影响，但其主要作用是能不可逆地与细菌核糖体30S 亚基结合，抑制蛋白质合成的起始及密码子识别阶段。临床上使用的氨基糖苷类抗生素链霉素是临床用于治疗结核杆菌和一些细菌感染的首选药物，但长期使用或剂量过大对第八对脑神经有显著损害严重时造成耳聋。含有2-去氧链霉胺的抗生素是临床上应用最多的抗生素，如卡

4、那霉素、庆大霉素、妥布霉素等，临床上用于细菌感染的治疗，其中庆大霉素对革兰氏阴性菌所致严重全身感染和对耐药的绿脓杆菌感染，疗效显著。链霉素链霉素是含有链霉胍的氨基环醇抗生素的主要成员。它是由链霉胍、链霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺构成的假三糖化合物。它的化学名称为N-甲基-a -L-葡萄糖胺-（1-2） -a-L-链霉糖-（1-4）-链霉月瓜。链霉素的化学结构链霉素分子中有 三个 碱性基团，其中 两个 是链霉胍上的强 碱性 胍基（ pKa11.5） ，第三个是葡萄糖胺上的弱碱性甲氨基（pKa7.7） 。所以，链霉素在水溶液中随pH不同可能以四种不同型式存在。当pH值很高时，链霉素成游离碱（Str

5、）型式，当pH值降低时，可逐渐电离成一价正离子（Str.H+） 、 二价正离子（Str.H22+） ， 在中性及酸性溶液中，就成为三价正离子（Str.H33+） 。链霉素的物理性质（ 1）稳定性链霉素比青霉素稳定。干燥的粉末对空气和阳光均不敏感，含水量3%的粉末，在室温下，最少可以存放2 年。但链霉素及其盐均很吸潮，吸潮后，链霉素的稳定性大大下降。此外，链霉素中的杂质含量对链霉素的稳定性有明显的影响。链霉素的水溶液比较稳定。如链霉素盐的水溶液在pH4-7 时， 室温下放置数星期，仍然很稳定。但如果在 pH3以下或pH8以上时，链霉素的稳定性就大大降低。温度与链霉素水溶液的稳定性也有关。（ 2）

6、溶解性链霉素因含有极性集团氨基和羟基，故链霉素及其盐类都易溶于水，难溶于有机溶剂。但链霉素盐酸盐易溶于甲醇、难溶于乙醇。而链霉素硫酸盐在甲醇、乙醇中都很难溶，在苯甲酸中却有一定的溶解度。（ 3）旋光性链霉素等抗生素分子中有许多手性碳原子，故这些抗生素及盐类均有一定的旋光性。这些盐的比旋度和浓度存在曲线关系，故在一定范围内，可以用旋光法直接迅速地测定样品中各种链霉素盐类的浓度。该法在工业生产上用处很大。链霉素的化学性质（ 1）醛基的反应链霉素因含有醛基，故有醛类化合物的化学性质。链霉素中的醛基，可以被还原成羟基，从而使链霉素被还原成二氢链霉素。由于醛基易被氧化，即使是很弱的氧化剂也可将其氧化，故

7、链霉素被溴水氧化后，产生链霉酸。链霉素在碱性条件下，与伯胺化合物（如苯甲胺）反应， 生成希夫碱沉淀。这种沉淀在水中不易分解，用酸性或强酸性阳离子交换树脂处理，则又分解为链霉素和苯甲胺。在生产中可以用此原理来分离精制链霉素。先让链霉素与苯甲胺反应，生成希夫碱沉淀，将链霉素从水中提出，并能出去链霉胍等杂质。再将沉淀用树脂处理，即可得到链霉素的结晶。（ 2）降解反应链霉素在酸、碱的作用下，都会产生水解反应。如在温和的酸性条件下，被水解成链霉胍及链霉二糖胺。在稀碱溶液中，也能发生上述反应，但链霉二糖胺会进一步水解为链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺，而链霉糖经分子重排形成麦芽酚，具有酚的性质。链霉素的生物

8、合成同位素标记试验证实，链霉素的3个亚单位的碳架直接来源于 D-葡萄糖，月瓜基碳原子部分来自D-葡萄糖的降解产物。（ 1）链霉胍的生物合成（ 2）链霉糖的生物合成N-甲基-L-葡萄糖胺的生物合成（ 4）链霉素合成中三个亚单位的连接链霉素的发酵工艺及过程（ 1）生产菌种链霉素生产使用的菌种灰色链霉菌（ S.griseus ），后来又找到了产生链霉素或其它链霉素族抗生素产生菌，如比基尼链霉菌（ S.bikiniensis ）， 灰肉链霉菌（ S.griseocarneus ） 等。（ 2）发酵工艺流程（ 3）发酵工艺要点孢子的培养将冷冻管或砂土管的菌种接到琼脂斜面上，经培养就可以得到孢子。一般要求

9、进行二次转接。从母斜面接种至子斜面用单菌落接种，这样， 可以消除菌种中的变异菌体，纯化灰色链霉菌，防止生产菌种的退化。用于接种子代斜面的菌落要求分布均匀，密度适中，颜色洁白，菌落丰满。外形为梅花型和馒头型，菌落背面棕色。种子的培养种子是由斜面孢子通过摇瓶和种子罐培养产生大量菌丝，这些菌丝可用来接种生产更多的种子，也可以用来接种发酵罐。链霉素的种子培养，先由斜面孢子接种到摇瓶中，培养产生菌丝。可由该菌丝直接接种到种子罐扩大培养，也可用摇瓶再培养一次，然后移入种子罐。灰色链霉菌种子罐的培养一般要经过2-3 级。一级种子罐的接种量很小, 只有 0.2%-0.4%，二级、三级种子罐的接种量则要求达到1

10、0%左右，由种子罐接种至发酵罐则应该达到约20%的接种量。种子罐的种子培养，要求严格控制好温度、通气和搅拌、泡沫的消除等条件。保证菌丝生长良好，得到合乎要求的种子。接种发酵罐的种子要求无杂菌，种子液pH6.0-7.0 ;残糖小于2.0%,残氮小于80mg/100mL菌丝完全长浓，效价在 2000U/mL 以上。发酵的培养基控制链霉素发酵是链霉素生产的最关键环节。发酵的成功与否，链霉素发酵单位的高低，在很大程度上取决于链霉素的发酵培养基。链霉素的发酵培养基主要由葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、硫酸盐和碳酸钙等组成。碳源、氮源、无机盐等。链霉菌发酵条件的控制通气和搅拌、温度、pH值、泡沫与消沫、

11、补料、异常发酵的处理链霉素的提取和精制发酵液的过滤及预处理发酵终了时，链霉菌所产生的链霉素，有一部分是与菌丝体相结合的。用酸、碱或盐作短时间处理后，与菌丝体相结合的大部分链霉素就能释放出来。工业上， 常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，以草酸效果较好，可用草酸将发酵液酸化至pH3左右，直接蒸汽加热7075C,维持2min（这样能使蛋白质凝固，提高过滤速度） ，迅速冷却，过滤或离心分离。过滤后， 所得酸性滤液也可进行碱处理，进一步除去蛋白质，或直接用NaOH调pH至6.77.2 0选择原液pH值为中性附近是根据链霉素的稳定性、解离度或树脂的解离度等三方面确定的，pH在7附近，既可保证链霉素不受破坏，又

12、使链霉素或钠型羟基树脂全部溶解，有利于离子交换。为了保证链霉素不被破坏，温度应当适宜降低，所以维持在10左右。原液中的高价离子（ Ca2+， Mg2+） 对离子交换吸附影响很大，因此必须在发酵液预处理时将这些离子去掉。草酸能将Ca2+ 去除掉。 一些络合剂如三聚磷酸钠（NaP3。），能和Mg2然成络合物，减少树脂对 Mg2+勺吸附。吸附和解吸链霉素在中性溶液中是三价阳离子，可以用阳离子交换树脂吸附。试验表明，磺酸基树酯虽能吸附链霉素，但二者亲和力太强，不易用酸洗脱下来。羧基树脂吸附链霉素后，用酸就很容易洗下来。目前生产上都用羧基树脂的钠型来提取链霉素。其交换吸附和洗脱的反应可用下列方程式表示：精制洗脱液中尚含有许多无机和有机杂质，这些杂质对产品质量的影响很大，特别是与链霉素理化性质近似的一些有机阳离子杂质毒性较大，如链霉胍，二链霉胺，杂质1 号（由链霉胍和双氢链霉糖两部分组成的糖苷）等，可采用下列精制方法：* 高交联度树脂精制高交联度的氢型磺基树脂的结构紧密，金属小离子可以自由地扩散到孔隙度很小的树脂内部与阳离子交换，而有机大分子就难于扩散到树脂内部进行交换。用这种树脂来精制链霉素溶液，溶液中的小离子和链霉素有机大离子在树脂上的吸附速度不同，从而起到离子筛选的作用，达到分离的目的。经过这步精制后，链霉胍小分子也能被除去。* 浓缩和活性炭脱色为了适