蒋3 卵巢上皮癌组织中

1、PAGE 卵巢上皮癌组织中ERCC1基因mRNA表达水平与患者化疗反应性和生存期的关系前言卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌是妇产科最常见的三大恶性肿瘤，随着宫颈癌和子宫内膜癌的早期诊断和治疗已经取得了巨大的进步，卵巢癌已经成为严重威胁女性生命的恶性肿瘤，发现之时多已处于晚期，五年生存率一直在25%30%徘徊1-3。以铂类药物为基础的化学治疗是卵巢癌除手术之外的主要辅助治疗手段，既可用于预防术后的复发，也可用于手术未能全部切除者，部分患者可获暂时缓解，甚至长期存活。然而有20%到30% 的患者对一线化疗药物始终无反应，初治有反应的患者仍有部分会发生继发耐药。研究表明明，铂类类药物的的耐药和和核酸切切除

2、修复复系统（nuccleootidde eexciisioon rrepaair, NEER）密密切相关关，NEER系统统可以修修复铂类类化疗药药所造成成的DNNA损伤伤，从而而降低患患者对化化疗的敏敏感性4-99。切切除修复复交叉互互补基因因1(eexciisioon rrepaair crooss-commpleemenntattionn grroupp 1，ERCCC1)是NEER系统统中的一一个关键键基因，其表达达量与肺肺癌、胃胃癌、前前列腺癌癌患者的的预后相相关。EERCCC1基因因共100个外显显子，可可分别转转录为两两个剪接接体，含含10个个外显子子的全长长剪接体体mRNNA (

3、fulll llenggth, FLL),和和缺失第第VIIII外显显子（长长72bbp）的的变异剪剪接体mmRNAA( aalteernaativve sspliicinng, AS)。本研研究使用用TaqqMann实时荧荧光定量量RT-PCRR法检测测卵巢癌癌组织中中ERCCC1的的变异剪剪接体的的表达量量，以期期对此变变异剪接接的临床床意义进进行探讨讨。试验流程程1 材料料与方法法1.1纳纳入标准准：我院自220000年1月月至20006年年12月月所收治治的原发发性卵巢巢上皮癌癌患者，术前未未接受化化疗，术术后经病病理确诊诊。全部部标本均均经病理理科医师师切片确确诊，病病理科医医生并不

4、不知道病病人纳入入与排除除的情况况，充分分使用了了盲法。术后至至少接受受3个疗疗程的以以铂类为为基础的的化疗。术前均均签署知知情同意意书，允允许所切切除卵巢巢组织保保存于我我院并被被用于科科学研究究。1.2 排除标标准：接受术前前化疗者者；卵巢巢非上皮皮性癌者者；病例例资料不不完整者者；切除除卵巢组组织未行行保存或或者保存存不善以以致无法法提取RRNA者者；拒绝绝将切除除组织用用于科研研者。符合以上上纳入与与排除标标准者共共计633例卵巢巢上皮癌癌患者纳纳入研究究。1.3诊诊断标准准：全部标本本均经病病理科医医师切片片确诊。组织学学分级标标准主要要依据世世界卫生生组织（Worrld Heaal

5、thh Orrgannizaatioon，WWHO）19773年制制定的卵卵巢组织织学分类类法进行行组织学学的分类类和分级级，并参参照细胞胞分化程程度分33级：分化11级，为为高度分分化；分化22级，为为中度分分化；分化33级，为为低度分分化。卵巢恶性性肿瘤的的病理分分级、分分期根据据国际妇妇产科联联盟（Fddraatioon IInteernaatioonalle dde GGyncollogiie eet ddObbsttriiquee, FFIGOO）20000年年修订的的临床分分期标准准来判断断临床期期别：卵巢恶性性肿瘤的的手术-病理分分期FIGOO TNMM0 原原发肿瘤瘤无法评评价

6、 TX无原发肿肿瘤证据据 T00 肿瘤瘤局限于于卵巢 T11a 肿瘤瘤局限于于一侧卵卵巢，包包膜完整整，表面面无肿瘤瘤， T1a腹水或腹腹腔冲洗洗液中未未查见恶恶性细胞胞。b 肿瘤瘤局限于于两侧卵卵巢，包包膜完整整，表面面无肿瘤瘤，T11b腹水或腹腹腔冲洗洗液中未未查见恶恶性细胞胞。c 肿瘤瘤局限于于单侧或或双侧卵卵巢，伴伴有以下下任何一一项者：T1c包膜破裂裂、卵巢巢表面有有肿瘤、腹水或或冲洗液液中有恶恶性细胞胞。 肿瘤累累及一侧侧或双侧侧卵巢，伴盆腔腔内转移移。T22a 肿瘤瘤蔓延和和/或转转移到子子宫和/或输卵卵管， T22a腹水或冲冲洗液中中无恶性性细胞。b 肿瘤瘤蔓延到到盆腔其其它组

7、织织，腹水水或冲洗洗液中无无恶性细细胞。TT2bc a 或b病变，但腹水水或冲洗洗液中查查见恶性性细胞。T2bb肿瘤侵侵犯一侧侧或双侧侧卵巢，镜检证证实盆腔腔外有腹腹膜转移移 TT3和/或N11和/或区区域淋巴巴结转移移。a 镜检检证实盆盆腔外腹腹膜转移移超出盆盆腔外。 T3ab 盆腔腔外腹膜膜大块转转移灶最最大径线线2cmmT3bbc 盆腔腔外腹膜膜转移灶灶最大径径线2cm， T3c和/或N11和/或区区域淋巴巴结转移移 远远处转移移（腹膜膜转移除除外） M11注： 肝肝包膜转转移为TT3/期，肝肝实质转转移为MM1/期。胸膜膜渗出液液必须有有阳性细细胞才能能分为MM1/期。N00-无区区域

8、淋巴巴结转移移，N11-区域域淋巴结结转移。M0-无远处处转移，M1-远处转转移（腹腹膜转移移除外）。1.4 化疗效效果判断断标准：判断标准准参照曾曾益新主主编的肿瘤学学第22版第4410页页，以临临床检查查，CAA-1225和影影像学检检查结果果来判断断，肿瘤完全全消失超超过一个个月为完完全缓解解（coomplletee reemisssioon, CR）；肿瘤体积积缩小超超过500%且持持续一个个月以上上为部分分缓解（parrtiaal rremiissiion, PRR）；肿瘤体积积增大超超过500%或有有新病灶灶的出现现为进展展（prrogrresssivee, PP）；肿瘤体积积变化

9、不不超过225%为为稳定（Staablee, SS）。对化疗敏敏感的定定义：完完全缓解解与部分分缓解均均为敏感感，对化化疗有反反应。对化疗耐耐药的定定义：进进展与稳稳定均为为耐药，对化疗疗无反应应。随访：生生存时间间的计算算方法为为从接受受治疗之之初到随随访结束束或者死死亡之时时。经门门诊随访访或者电电话和信信件随访访。1.5主主要仪器器超速低温温离心机机德国国西门子子公司TGL-16CC台式高高速离心心机 上海海安亭科科学仪器器厂Gel docc 20000 凝胶成成像分析析系统美国国Biio-RRad公司紫外可见见分光光光度计 北北京普析析通用仪仪器有限限责任公公司普通PCCR扩增增仪美美

10、国热电电公司TTherrmo eleectrron corrporratiion电动玻璃璃匀浆机机宁波玻玻璃仪器器厂OLYMMPUSS光学显显微镜日日本OLLYMPPUS公公司恒温水浴浴箱国产产冰浴加样样盒国产产桥式水平平电泳仪仪槽 北京崇崇文东方方仪器厂厂DYY-型稳压压稳流电电泳仪 北京六六一仪器器厂 Epppenddorff管 国国产各式微量量移液器器 美美国Giilsoon公司司 超超低温冰冰箱中国国海尔公公司Chroomo44 Reeal-Timme PPCR Dettecttor实实时荧光光定量PPCR仪仪购自自美国BBio-radd公司；荧光定量量PCRR管0.2mll薄薄壁美国

11、国Ceppheiid 公公司Smmarttcycclerr 1.6 主要试试剂及配配制(1) TRiizoll 试剂剂 购自自Invvitrrogeen公司司(2)FFirsst SStraand cDNNA SSyntthessis Kitt 逆转转录试剂剂盒 购购自MBBI FFermmenttas 公司，内含： MM-Muulv 反转录录酶 OOliggo(ddT)118 (0.55g/l)高浓度ddNTPP10mmM dNTTPRNA酶酶抑制剂剂Rnaasinn innhibbitoor 55reeacttionn buuffeer(3) Taqq PCCR MMastter Mixx

12、 购自自 TIIANGGEN生生物有限限公司 (4)异丙醇醇、无水水乙醇 国药药集团化化学试剂剂有限公公司(5)焦焦碳酸二二乙酯(DEPPC) 上上海生物物工程公公司(6)三三氯甲烷烷（氯仿仿） 东风风化工厂厂(7)溴溴化乙锭锭EtBBr 上海生生物工程程公司(8)琼琼脂糖 上海捷捷瑞生物物技术公公司(9) 50TAEE BBIOWWESTT AGGAROOSE公公司(10) 500bp Laddderr DNNA Marrkerr 购自自 大连宝宝生物公公司1.6.1 主主要试剂剂的配制制(1) 0.11%DEEPC水水配制0.1焦碳酸酸二乙酯酯（DEEPC）是RNNA酶的的强烈抑抑制剂，所

13、有接接触RNNA的器器具均需需经过含含0.11%的DDEPCC的水浸浸泡过夜夜以便去去器具上上面沾染染的RNNA酶，浸泡后后高温高高压消毒毒。10000ml双双蒸水中中加入11ml DEPPC，充充分震荡荡混匀，配制成成含0.1%DDEPCC的水备备用。含0.11%DEEPC的的水放置置过夜，大概116小时时后，吸吸取1000mll，经高高温高压压30mmin后后，即可可除去DDEPCC，成为为不含RRNA酶酶的水。可用于于RNAA的提取取和逆转转录。(2)RNAA酶的去去除RNA酶酶可以降降解RNNA, 破坏RRNA的的完整性性,影响响试验结结果，所所以在提提取RNNA的整整个过程程都要严严

14、防RNNA酶的的存在。为减少少RNAA酶的污污染，所所用的TTip头头、Epppenndorrf离心心管等塑塑料制品品均先用用0.11%二乙乙基焦碳碳酸酯(DEPPC水)浸泡过过夜，后后高压消消毒除去去残存的的DEPPC，进进口塑料料管已经经过射线线消毒，可直接接使用；其它玻玻璃、陶陶瓷器皿皿均需先先水洗晾晾干后，再经重重铬酸钾钾-硫酸酸洗液浸浸泡过夜夜，洗净净后2000干烤44-6小小时，方方能使用用。所以以物品均均现配现现用。(3)EtBBr溶液液的配制制溴化乙锭锭EtBBr是有有毒物质质，皮肤肤不可以以直接接接触，整整个配置置过程都都要戴橡橡胶手套套，在通通风厨中中进行。配置的的溴化乙乙

15、锭贮存存浓度为为10mmg/mml，工工作液的的浓度为为2000g/mml。首先将溴溴化乙锭锭0.55g溶解解于500ml三三蒸水中中，充分分搅拌溶溶解后放放置于棕棕色瓶中中4避光保保存。使使用时取取10mmg/mml的贮贮存液2200l稀释释于100ml三三蒸水中中。（4）550TAEE电泳缓缓冲液的的配制Triss 12.1g0.5mmmoll/L EDTTA(PPH=88.0) 55.0mml冰醋酸 22.9mml首先称取取Triis122.1gg加入440mll三蒸水水中，依依次加入入0.55mmool/LL EDDTA(PH=8.00) 55.0mml，冰冰醋酸22.9mml，充充分

16、搅拌拌溶解后后用三蒸蒸水补足足至500ml，高压灭灭菌后室室温保存存，作为为贮存液液。使用用时，取取20mml加蒸蒸馏水至至10000mll，即得得1TAEE的工作作液。（5）不不同浓度度琼脂糖糖凝胶配配制1.00琼脂脂糖凝胶胶 550mll琼脂糖 00.5gg1TAAE 50mml1.55琼脂脂糖凝胶胶 550mll琼脂糖 00.755g1TAAE 50mml称取所需需剂量的的琼脂糖糖粉末，加入所所需体积积的TAAE缓冲冲液中，置于微微波炉中中间断加加热，使使琼脂糖糖完全溶溶解，其其间不断断缓慢摇摇动锥形形瓶，使使贴于壁壁上的琼琼脂充分分溶解。冷却至至50左右，加入2200g/mml溴化化乙

17、锭(EB液液)1225l混匀匀(使终终浓度为为0.55g/mml)。2 方法法2.1试试验前RRNA酶酶的去除除：采用Trrizool试剂剂一步法法提取卵卵巢组织织RNAA：为减减少RNNA酶的的污染，该方法法中所用用的Tiip头、Epppenddorff离心管管等塑料料制品均均先用00.1%二乙基基焦碳酸酸酯(DDEPCC水)浸浸泡过夜夜，高压压消毒除除去残存存的DEEPC。进口离离心管已已经过射射线消毒毒，可直直接使用用；其它它玻璃、陶瓷器器皿均需需先水洗洗晾干后后，再经经重铬酸酸钾-硫硫酸洗液液浸泡过过夜，洗洗净后2200干烤446小小时，方方能使用用。一般般去除RRNA酶酶的用具具立即

18、使使用。人人的皮肤肤是RNNA酶污污染的重重要来源源，用具具处理过过程中和和试验过过程中均均主意戴戴手套和和帽子。空气中中含有RRNA酶酶，去除除RNAA酶的用用具需要要用布包包裹，容容器需要要盖上盖盖子，且且不宜放放置过久久。2.1.2总RRNA提提取RNA是是极易受受到RNNA酶的的降解，在提取取RNAA过程中中最关键键的是抑抑制RNNA酶活活性,所所以的用用具均需需经过含含0.11%DEEPC的的水浸泡泡过夜后后高温高高压消毒毒。RNNA提取取基本原原理是通通过变性性剂破碎碎细胞或或者组织织，然后后经过氯氯仿等有有机溶剂剂抽提RRNA，再经过过沉淀，洗涤，晾干，最后溶溶解。已已经有商商品

19、化的的RNAA提取试试剂盒出出售，如如美国IInviitroogenn公司的的TRIIZoll和日本本Takkaraa公司的的RNAAisoo。本试试验采用用美国IInviitroogenn公司的的TRIIZoll试剂提提取RNNA。TTRIZZol为为高浓度度强变性性裂解液液，可迅迅速破坏坏细胞结结构，使使RNAA从细胞胞中释放放出来，同时TTrizzol试试剂还含含有Rnnasee抑制剂剂使细胞胞内RNNA酶失失活，RRNA不不被降解解，同时时氯仿能能将细胞胞碎片、DNAA、蛋白白质与RRNA分分离开来来，得到到纯化的的总RNNA，焦焦碳酸二二乙酯(DEPPC)是是一种强强烈的RRNA酶酶

20、抑制剂剂，用它它来浸泡泡实验所所用器具具，及配配制700%乙醇醇，保证证实验过过程不产产生RNNA酶污污染，并并且使所所得RNNA有较较高的纯纯度，几几乎不含含有基因因组DNNA。实验步骤骤：本次研究究采用美美国Innvittroggen公公司生产产的Trrizool试剂剂一步法法提取卵卵巢组织织总RNNA，以以便得到到高质量量的RNNA，对对卵巢癌癌组织中中的目的的mRNNA进行行定量分分析。具具体步骤骤如下：(1) 从液氮氮罐内取取出保存存的卵巢巢癌组织织，并逐逐一核对对住院号号和姓名名，剪取取约2000mgg卵巢癌癌组织迅迅速置于于液氮中中，在液液氮中使使用研钵钵将卵巢巢癌组织织研磨成成

21、粉末后后加入TTrizzol 试剂11mL，充分混混匀。(2) Triizoll充分溶溶解后的的卵巢癌癌组织浆浆转入11.5mmL离心心管中，加0.25mmL氯仿仿，充分分振荡混混匀，冰冰浴155minn。(3) 在4低温1130000rppm，离离心155minn。(4) 小心吸吸取上层层水相至至另一11.5mmL离心心管中，RNAA存在于于上层水水相，在在吸取时时注意不不要吸到到蛋白层层或有机机相，以以免蛋白白等杂质质的污染染。加等等体积异异丙醇，摇匀，室温放放置100minn，在44低温1130000rppm，离离心155minn，沉淀淀RNAA。(5) 加700%乙醇醇漂洗沉沉淀，在在

22、4低温550000rpmm，离心心10mmin，小心弃弃去乙醇醇，空气气中干燥燥10mmin。(6) 加入440l 经经DEPPC处理理过的，不含RRNA酶酶的双蒸蒸水完全全溶解总总RNAA。2.1.3总RRNA的的定量及及纯度测测定：为了检测测所提取取RNAA的纯度度和质量量，使用用紫外分分光光度度计测量量RNAA溶液的的吸光值值，并使使用琼脂脂糖凝胶胶电泳检检测条带带。(1) 总RNNA定量量分析：用dddH2O稀释释3LRNNA样品品至1550L，充充分混匀匀；用紫紫外分光光光度仪仪测总RRNA的的OD2260、OD2280的的吸光值值，计算算OD2260/OD2280比比值，比比值大于

23、于1.880，表表明纯度度符合要要求，如如低于此此值，表表明存在在蛋白质质污染，需重新新用酚/氯仿抽抽提。通通过ODD2600值计算算RNAA总浓度度：总RNAA浓度(ug/L)=(A2260 400稀释倍倍数)/10000(2) 琼脂糖糖凝胶电电泳检测测RNAA的完整整性：选选用专用用电泳槽槽、制胶胶板、梳梳子，先先用无水水乙醇擦擦洗，晾晾干后用用0.11DEEPC处处理过的的ddHH2O彻底底冲洗，再用无无水乙醇醇洗一次次，待乙乙醇挥发发后即可可使用。制备11琼脂脂糖凝胶胶，其中中含有00.5g/mll的溴化化乙锭以以便使PPCR产产物在紫紫外灯下下显色。取2L总RRNA溶溶液加11L上样

24、样缓冲液液点样，以5VV/cmm稳压电电泳，紫紫外灯下下可见228s、18ss、5ss三条rrRNAA的清晰晰条带，但是有有时5ss条带并并不能总总是理想想的显示示，本次次研究所所纳入的的卵巢癌癌组织有有些在液液氮中保保存时间间很久，有些不不能清晰晰的显示示5s的的rRNNA条带带。结果果见图。Bio-radd凝胶成成像仪成成像，使使用quualiity-onee软件分分析知其其28SS条带亮亮度是118S亮亮度的22倍。表表明RNNA提取取的质量量很好，可以用用于本次次研究。2.2逆逆转录ccDNAA2.2.1逆转转录引物物的选择择：以提取到到的总RRNA作作为模板板，使用用引物和和逆转录录

25、酶逆转转录成ccDNAA.通常常可以选选用的引引物有三三种：1.胸胸腺嘌呤呤寡聚体体Oliigo（dT）182.随随机六聚聚体引物物ranndomm heexammer priimerr3.序序列特异异的引物物seqquennce-speeciffic priimerr细胞内的的mRNNA在33端为ppolyyA，OOliggo（ddT）118作为为引物与与pollyA互互补，使使用Olligoo（dTT）188作为引引物能够够将所提提取的总总RNAA中含有有pollyA 的mRRNA逆逆转录为为cDNNA，所所得到的的cDNNA利于于后续的的PCRR扩增基基因全长长，利于于构建基基因全长长的

26、载体体，而且且对于引引物与总总RNAA的比例例要求不不严体，不需要要对引物物与总RRNA的的比例进进行优化化。随机六聚聚体引物物为四种种脱氧核核糖核酸酸(A,T,GG,C)的随机机组合，使用此此引物逆逆转录的的cDNNA长短短不一，随机六六聚体引引物与总总RNAA的物质质的量的的比例对对所得到到的cDDNA长长度有关关键性的的影响，提高引引物与总总RNAA的比例例能够得得到较短短的cDDNA产产物，通通常小于于5000bp; 如果果降低引引物与总总RNAA的比例例则使长长的cDDNA产产物增长长。因此此实验前前对随机机六聚体体引物与与总RNNA的比比例进行行优化是是必要的的。序列特异异的引物物

27、则适用用于单管管RT-PCRR(onne ttubee),逆逆转录的的引物是是针对目目的基因因而设计计的。OOliggo（ddT）118与随随机六聚聚体引物物适用于于两管RRT-PPCR。(toow ttubee).本研究采采用两管管RT-PCRR法，使使用随机机六聚体体引物rranddom hexxameer pprimmer作作为逆转转录引物物以便得得到较多多的cDDNA产产物。2.2.2逆转转录酶的的选择目前广为为使用的的逆转录录酶是四四种，具具体如下下：1 MMoneey 鼠鼠白血病病病毒（MMLLV）反反转录酶酶：有强强的聚合合酶活性性，RNNA酶HH活性相相对较弱弱。最适适作用温温

28、度为337。2 禽禽成髓细细胞瘤病病毒（AAMV）反转录录酶：有有强的聚聚合酶活活性和RRNA酶酶H活性性。最适适作用温温度为442。3Thhermmus theermoophiiluss、Thhermmus flaavuss等嗜热热微生物物的热稳稳定性反反转录酶酶：在MMn2+ 存在在下，允允许高温温反转录录RNAA，以消消除RNNA模板板的二级级结构。4MMMLV反反转录酶酶的RNNasee H-突变体体：商品品名为SSupeerSccrippt 和和SupperSScriipt。此种种酶较其其它酶能能多将更更大部分分的RNNA转换换成cDDNA，这一特特性允许许从含二二级结构构的、低低温

29、反转转录很困困难的mmRNAA模板合合成较长长cDNNA。本次研究究采用FFermmenttas公公司的MMolooneyy Muurinne LLeukkemiia VViruus rreveersee trransscriiptaase，(M-MuLLV RRT),此酶具具有低的的RNaase H活性性,以便便从较长长的模板板（最长长可达113kbb）中得得到全长长cDNNA序列列。2.2.3具体体步骤详详细叙述述如下：所有操作作均在冰冰上进行行。在00.5mml EEppeendoorf管管内加入入以下反反应体系系：总RNNA 0.55-5g随机六聚聚体引物物ranndomm heexa

30、mmer priimerr 11l RNNasee frree水水 至总总体积 112l稍离心混混匀后，70反应55分钟，立即置置于冰上上冰浴55分钟依次加加入以下下各成分分：5Reeacttionn Buuffeer 4l10mMMdNTTP MMix 22lRNA酶酶抑制剂剂(RiiboLLockk Riibonnuclleasse iinhiibittor)(200u/l) 1l稍离心混混匀各成成分，由由于使用用了随机机六聚体体引物rranddom hexxameer pprimmer ，故此此步骤在在25下反应应5分钟钟。加逆转转录酶MM-MuuLV(2000u/l) 11l由于使用用

31、了随机机六聚体体引物rranddom hexxameer pprimmer ，故此此步骤首首先在225反应110分钟钟，然后后在422反应660分钟钟。72110分钟钟灭活逆逆转录酶酶迅速置置于冰浴浴中5分分钟，以以防cDDNA结结合成双双链-200保存。质量检检测：制制作含有有0.55g/mml溴化化乙锭的的1.55%琼脂脂糖凝胶胶，然后后加入逆逆转录产产物4l及上上样缓冲冲液2uul，电电泳使溴溴酚蓝前前移2ccm左右右，凝胶胶成像分分析仪可可见较宽宽的电泳泳区带呈呈片状。2.3 TaqqMann实时荧荧光定量量PCRR实验原理理：定义：实实时荧光光定量PPCR技技术，是是指在PPCR反反

32、应体系系中加入入荧光基基团，利利用荧光光信号积积累实时时监测整整个PCCR进程程，最后后通过标标准曲线线对未知知模板进进行定量量分析的的方法。实时荧荧光定量量 PCCR 技技术是 DNAA 定量量技术的的一次飞飞跃。运运用该项项技术，可以对对 DNNA 、 RNNA 样样品进行行定量和和定性分分析。定定量分析析包括绝绝对定量量分析和和相对定定量分析析。前者者可以得得到某个个样本中中基因的的拷贝数数和浓度度；后者者可以对对不同方方式处理理的两个个样本中中的基因因表达水水平进行行比较。除此之之外还可可以对 PCRR 产物物或样品品进行定定性分析析：例如如利用熔熔解曲线线分析识识别扩增增产物和和引物

33、二二聚体，以区分分非特异异扩增；利用特特异性探探针进行行基因型型分析及及 SNNP 检检测等。 目前前实时荧荧光 PPCR 技术已已经被广广泛应用用于基础础科学研研究、临临床诊断断、疾病病研究及及药物研研发等领领域。原理：聚聚合酶链链式反应应 ( PCRR) 可可对特定定核苷酸酸片断进进行指数数级的扩扩增 。在扩增增反应结结束之后后，可以以通过凝凝胶电泳泳的方法法对扩增增产物进进行定性性的分析析，也可可以通过过放射性性核素掺掺入标记记后的光光密度扫扫描来进进行定量量的分析析 。无无论定性性还是定定量分析析，分析析的都是是 PCCR 终终产物。而实时时荧光定定量 PPCR 则是通通过对 PCRR

34、 扩增增反应中中每一个个循环产产物荧光光信号的的实时检检测从而而实现对对起始模模板定量量及定性性的分析析。在实实时荧光光定量 PCRR 反应应中，引引入了一一种荧光光化学物物质，随随着 PPCR 反应的的进行， PCCR 反反应产物物不断累累计，荧荧光信号号强度也也等比例例增加。每经过过一个循循环，收收集一个个荧光强强度信号号，这样样就可以以通过荧荧光强度度变化监监测产物物量的变变化，从从而得到到一条荧荧光扩增增曲线图图：Fig Thhressholld vvaluue ccurvve aand CT vallue曲线阈值值与Ctt值荧光扩增增曲线可可以分成成三个阶阶段：荧荧光背景景信号阶阶段

35、，荧荧光信号号指数扩扩增阶段段和平台台期。在在荧光背背景信号号阶段，扩增的的荧光信信号被荧荧光背景景信号所所掩盖，无法判判断产物物量的变变化。而而在平台台期，扩扩增产物物已不再再呈指数数级的增增加，所所以PCCR 的的终产物物量与起起始模板板量之间间没有线线性关系系，根据据最终的的 PCCR 产产物量不不能计算算出起始始 DNNA 拷拷贝数。只有在在荧光信信号指数数扩增阶阶段， PCRR 产物物量的对对数值与与起始模模板量之之间存在在线性关关系，可可以选择择在这个个阶段进进行定量量分析。为了定定量和比比较的方方便，在在实时荧荧光定量量 PCCR 技技术中引引入了两两个非常常重要的的概念：荧光阈

36、阈值和 CT 值。荧荧光阈值值是在荧荧光扩增增曲线上上人为设设定的一一个值，它可以以设定在在荧光信信号指数数扩增阶阶段任意意位置上上，每个个反应管管内的荧荧光信号号到达设设定的域域值时所所经历的的循环数数被称为为 CTT 值（ thhressholld vvaluue ）。CTT 值与与起始模模板的关关系研究究表明，每个模模板的 CT 值与该该模板的的起始拷拷贝数的的对数存存在线性性关系，起始拷拷贝数越越多， CT 值越小小。利用用已知起起始拷贝贝数的标标准品可可作出标标准曲线线，其中中横坐标标代表起起始拷贝贝数的对对数，纵纵坐标代代表 CCT 值值。因此此，只要要获得未未知样品品的 CCT

37、值值，即可可从标准准曲线上上计算出出该样品品的起始始拷贝数数。Fig Sttanddarddardd cuurvee实时荧光光定量PPCR的的标准曲曲线实时荧光光定量 PCRR 的化化学原理理包括探探针类和和非探针针类两种种，探针针类是利利用与靶靶序列特特异杂交交的探针针来指示示扩增产产物的增增加，非非探针类类则是利利用荧光光染料或或者特殊殊设计的的引物来来指示扩扩增的增增加。前前者由于于增加了了探针的的识别步步骤，特特异性更更高，但但后者则则简便易易行。SSYBRR Grreenn I 是一一种结合合于小沟沟中的双双链 DDNA 结合染染料。与与双链 DNAA 结合合后，其其荧光大大大增强强

38、。这一一性质使使其用于于扩增产产物的检检测非常常理想。 SYYBR Greeen I的最大大吸收波波长约为为 4997nmm ，发发射波长长最大约约为 5520nnm 。 在 PCRR 反应应体系中中，加入入过量 SYBBR荧光光染料， SYYBR 荧光染染料特异异性地掺掺入 DDNA 双链后后，发射射荧光信信号，而而不掺入入链中的的 SYYBR 染料分分子不会会发射任任何荧光光信号，从而保保证荧光光信号的的增加与与PCRR 产物物的增加加完全同同步。 SYBBR GGreeen II在核酸酸的实时时检测方方面有很很多优点点，由于于它与所所有的双双链 DDNA 相结合合，不必必因为模模板不同同

39、而特别别定制，因此设设计的程程序通用用性且价价格相对对较低。利用荧荧光染料料可以指指示双链链 DNNA 熔熔点的性性质，通通过熔点点曲线分分析可以以识别扩扩增产物物和引物物二聚体体，因而而可以、区分非非特异扩扩增，进进一步地地还可以以实现单单色多重重测定。此外，由于一一个 PPCR 产物可可以与多多分子的的染料结结合，因因此 SSYBRR Grreenn I的灵敏敏度很高高。由解解链曲线线来分析析产物的的均一性性有助于于分析由由 SYYBR Greeen I得到定定量结果果。一般而言言，探针针法比染染料法（如SYYBR Greeen I）最广广泛使用用的TaaqMaan探针针就是运运用了这这个

40、原理理。PCCR扩增增时在加加入一对对引物的的同时加加入一个个特异性性的荧光光探针，该探针针为一寡寡核苷酸酸，两端端分别标标记一个个报告荧荧光基团团和一个个淬灭荧荧光基团团，此时时5端荧光光基团吸吸收能量量后将能能量转移移给临近近的3端荧光光淬灭基基团（发发生荧光光共振能能量转移移，FRRET），因此此探针完完整时，检测不不到该探探针5端荧光光基团发发出的荧荧光。但但在PCCR扩增增中，溶溶液中的的模板变变性后低低温退火火时，引引物与探探针同时时与模板板结合。在引物物的介导导下，沿沿模板向向前延伸伸至探针针结合处处，发生生链的置置换，TTaq酶酶的5-3外切酶酶活性（此活性性是双链链特异性性的

41、，游游离的单单链探针针不受影影响）将将探针55端连接接的荧光光基团从从探针上上切割下下来，游游离于反反应体系系中，从从而脱离离3端荧光光淬灭基基团的屏屏蔽，接接受光刺刺激发出出荧光信信号，即即每扩增增一条DDNA链链，就有有一个荧荧光分子子形成，实现了了荧光信信号的累累积与PPCR产产物形成成完全同同步。2.3.1 引引物设计计和内参参基因的的选择为了去除除不同标标本在RRNA的的产量、质量以以及逆转转录效率率上可能能存在的的差别而而获得目目标基因因特异性性表达的的真正差差异,通通常选择择一定的的内参基基因进行行校正和和标准化化。内参参基因扩扩增中的的变化可可以反映映RNAA产量、质量和和/或

42、ccDNAA合成效效率的变变化。选选择适当当的内参参基因以以减少检检测标本本间的差差异是必必须的。内参基基因应具具备的条条件理想想的内参参基因应应该满足足以下条条件:不存在在假基因因(psseuddogeene),以避避免基因因组DNNA的扩扩增;高度或或中度表表达,排排除太高高或低表表达;稳定表表达于不不同类型型的细胞胞和组织织(如正正常细胞胞和癌细细胞),而且其其表达量量是近似似的,无无显著性性差别;表达水水平与细细胞周期期以及细细胞是否否活化无无关;其稳定定的表达达水平与与目标基基因相似似;不受任任何内源源性或外外源性因因素的影影响,如如不受任任何实验验处理措措施的影影响。排除内参参基因

43、的的条件则则为:在正常常和异常常的细胞胞/组织织中的表表达存在在差异;呈现细细胞周期期依赖的的表达; 定位于于X染色色体。本次研究究选择人人betta-aactiin作为为内参基基因，可可以满足足以上条条件。采用第二二章已经经建立起起来到TTaqMMan实实时荧光光定量RRT-PPCR平平台，设设计的TTaqMMan探探针和引引物如下下：引物名称称序列(553)引物特征征产物长度度bpTERCCC1ATACCCCCCTCGGACGGAGGGATGGAG第= 2 * ROMANII外外显子末末端77ACAGGTGGGGAAAGGCCTCTTGTGGTAGGA第= 3 * ROMANIIII外显子

44、子始端FAM- CGGGAAATAAAGGGGCTTTGGCCCACCTCCCA-TTAMRRA第= 2 * ROMANII与与= 3 * ROMANIIII外显子子连接处处ASERRCC11CCAGGCGGGACCCTCCCTGAATG第= 7 * ROMANVIII外显子子末端151和和79*CTCTTTGAATGCCGGCCGATTGAGG第= 9 * ROMANIX外外显子始始端FAM-AGGGACTTTCGGTCTTCCCCGGTTCTCCTGGGAACC-TAAMRAA第= 7 * ROMANVIII与= 9 * ROMANIX外显显子连接接处TaqMMan betta-aacti

45、inGGCAACCCCAGCCACAAATGGAA1898GGAAAGGTTGGAACAGGCGAAGG18FAM-CAAAGATTCATTTGCCTCCCTCCCTGAAGCGGC-TTAMRRA252.3.2引物物和探针针的溶解解稀释由于合成成后的引引物Ollig Priimerr 和PProbbe呈膜膜状附在在管壁上上，在使使用前先先瞬时离离心，再再轻轻打打开管盖盖。加入入灭菌的的去离子子水，稀稀释成1100 mool/mml的贮贮存液，在使用用前调整整终浓度度至所需需的浓度度，置于于-200保存。在稀释释成工作作液时，使Prrimeer的浓浓度为550 moll/l，Prrobee的浓

46、度度为100mool/ll。2.3.3标准准品的构构建与标标准曲线线的扩增增将构建成成果的质质粒转化化入大肠肠杆菌后后提取质质粒，按按10倍倍浓度梯梯度依次次稀释做做为标准准品，以以此为模模板制作作标准曲曲线。每每个标本本均在三三个反应应体系中中同时用用三套引引物进行行扩增，每个标标本重复复三次。每次均均同时设设置3个个标准曲曲线。每每个组织织标本的的ERCCC1的的拷贝数数除以其其内参bbetaa-acctinn的拷贝贝数，其其商值作作为统计计分析的的数值。标准品品的构建建详见第第二章。2.3.4 TTaqMMan实实时荧光光定量PPCR检检测mRRNA表表达水平平首先将整整个反应应条件进进

47、行优化化，优化化后的分分析效率率在955%1105%，且相相关系数数在0.901.000之间间，每个个10倍倍的浓度度梯度之之间的CCt值相相差在33.3左左右，标标准曲线线的斜率率在-33.0左左右。在冰上溶溶解所需需试剂，使用ccooll sttartt技术避避免非特特异性扩扩增。TTaqMMan探探针注意意避光，配制过过程中将将PCRR反应管管用锡箔箔纸包裹裹避光。在冰上上配制如如下试剂剂：试剂体积（l）Taqq酶(55Ul-1)0.25510PPCR Buffferr（Mgg2+Frree）5MgCll2(25mmmolll-1)3dNTPP Miixtuure(各2.5 mmmoll

48、l-1)4模板质粒粒5Primmer Forrwarrd（550molll-1)1Primmer Revversse（550molll-1)1TaqMMan Proobe(10moll/l)2.5无菌水加水至550lTaqMMan荧荧光定量量PCRR反应温温度和时时间控制制：95预预变性33minn；94变变性1mmin,60退退火和延延伸1mmin,荧光探测测；45个循循环；于10保存。TaqMMan 实时荧荧光定量量PCRR程序设设置Proggramm foor TTaqMMan Reaal-ttimee quuanttitaativve PPCR ( DDraww byy Jiiangg

49、 Shhengg)每个标本本均在三三个反应应体系中中同时用用三套引引物进行行扩增，每个标标本重复复三次。每次均均同时设设置3个个标准曲曲线。2.4统统计分析析 根据临床床资料，按照患患者对化化疗的反反应性，将患者者区分为为化疗敏敏感组和和化疗耐耐药组，使用成成组t 检验比比较ERRCC11在化疗疗敏感和和耐药组组间的表表达差异异，取双双侧，以以=0.05为为检验水水准。以ERCCC1 mRNNA表达达量的中中位值为为界分为为ERCCC1高高表达组组和低表表达组，对随访访资料的的生存分分析采用用Kapplann-Meeierr法。使使用loog-rrankk teest对对数秩检检验对生生存期进

50、进行统计计检验。将可能能影响卵卵巢癌患患者化疗疗反应的的因素进进行Loogissticc多因素素统计回回归，将将有关影影响卵巢巢恶性肿肿瘤患者者生存期期的因素素进行CCox比比例风险险回归模模型分析析。数据据录入使使用软件件Miccrossoftt Exxcell 20003, 统计计数据处处理使用用软件SSPSSS13.5 ffor winndowws进行行。3. 结结果3.1病病人一般般资料所纳入的的63例例卵巢癌癌患者中中位年龄龄49岁岁（277岁667岁）。根据据国际妇妇产科联联盟（FFdrattionn Innterrnattionnalee dee Gyynccoloogiee e

51、tt dObsstttriqque, FIIGO）20000年修修订的临临床分期期标准来来判断临临床期别别，结果果：I期期4例（6.335%），III期6例例（9.52%），IIII期期45例例（711.433%），IV期期8例（12.70%）。纳入卵巢巢癌患者者的临床床期别Clinnicaal sstagge oof tthe inccludded ovaariaan ccanccer pattiennts期别例数构成比%I期46.355%II期69.522%III期期4571.443%IV期812.770%总计63100%另，按世世界卫生生组织（Worrld Heaalthh Orrgan

52、nizaatioon，WWHO）19773年制制定的卵卵巢组织织学分类类法进行行组织学学的分类类，结果果如下：浆液性性囊腺癌癌16例例（255.400%），粘液性性囊腺癌癌23例例（366.511%），透明细细胞癌77例（111.111%），子宫宫内膜样样癌9例例（144.300%），其它上上皮性卵卵巢癌88例（112.770%）。纳入卵巢巢癌患者者的组织织学类型型Histtoloogy typpe oof tthe inccludded ovaariaan ccanccer pattiennts组织学分分类例数构成比%浆液性囊囊腺癌1625.440%粘液性囊囊腺癌2336.551%透明细胞胞

53、癌711.111%子宫内膜膜样癌914.330%其它上皮皮性卵巢巢癌812.770%总计63100%另，按世世界卫生生组织（Worrld Heaalthh Orrgannizaatioon，WWHO）19773年制制定的卵卵巢组织织学分类类法进行行组织学学的分级级，G11高度分分化例（17.46%），GG2中度度分化220例（31.75%），GG3低度度分化332例（50.79%）。纳入卵巢巢癌患者者的组织织学分级级Celll diiffeerenntiaatioonoff thhe iinclludeed oovarriann caanceer ppatiientts组织学的的分级例数构成比

54、%高度分化化1117.446%中度分化化2031.775%低度分化化3250.779%总计63100%3.2 TaqqMann实时荧荧光定量量RT-PCRR检测mmRNAA使用构建建好的TTaqMMan实实时荧光光定量RRT-PPCR平平台检测测卵巢癌癌组织中中的ERRCC11基因总总量mRRNA，缺失第第8外显显子的EERCCC1变异异剪接体体的表达达量，分分析效率率在955%1105%，且相相关系数数在0.901.000之间间，每个个10倍倍的浓度度梯度之之间的CCt值相相差在33.3左左右，标标准曲线线的斜率率在-33.0左左右。加图3.3 卵巢癌癌组织EERCCC1表达达与化疗疗敏感性

55、性的关系系 63例患患者中有有34例例（533.577%）对对化疗敏敏感，其其中111人的EERCCC1 mmRNAA表达高高于中位位值，223人低低于中位位置；229例（46.43%）对化化疗耐药药，其中中20人人的ERRCC11 mRRNA表表达高于于中位值值，9人人低于中中位置。耐药组组的ERRCC11表达水水平明显显高于敏敏感组。缺失第第VIIII外显显子ERRCC11变异剪剪接体的的表达个个体差异异甚大，最高值值是最低低值的770倍，占ERRCC11 mRRNA总总量比例例变化亦亦甚大，从1.8%到到70.5%。统计分分析表明明，缺失失第VIIII外外显子变变异剪接接体的表表达量与与

56、卵巢癌癌化疗反反应性无无关。在在总量中中去除变变异剪接接体的量量后，EERCCC1全长长mRNNA的表表达水平平与化疗疗敏感性性具有更更低的PP值。ERCCC1 mmRNAA相对表表达量与与化疗敏敏感性的的关系The asssociiatiion of Cheemottherrapyy reespoonsee annd EERCCC1 mmRNAA exxpreessiionmRNAA表达量量（均数数SD）敏感244例耐药211例总ERCCC10.2660.3310.5110.332P=0.0433缺失第VVIIII外显子子变异剪剪接体0.04490.00320.0990.005P=0.08全

57、长ERRCC110.2110.1110.4550.226P=0.0233使用Loogissticc回归模模型（LLogiistiic rregrresssionn moodell）对影影响化疗疗反应的的因素进进行多因因素统计计分析，结果显显示临床床分期，病理学学分级和和组织学学类型以以及缺失失第VIIII外外显子变变异剪接接体不是是影响患患者化疗疗反应的的因素，ERCCC1 mRNNA表达达水平（总量）是影响响患者化化疗反应应的因素素。卵巢癌患患者化疗疗反应与与临床病病理的LLogiistiic回归归结果Logiistiic rresuultss off chhemootheerappy rr

58、espponsse aand cliiniccal patthollogyy变量回归系数数标准误自由度P值OR95%可可信区间间下限95%可可信区间间上限临床分期期0.95550.26610.6115.23.6778.722病理学分分级1.2330.72210.0773.2112.5334.711组织学类类型2.3550.13310.3223.5442.9114.322变异剪接接体1.9550.46610.9332.4661.4224.566ERCCC1 表表达水平平1.4330.09910.03342.7661.2663.7553.4 卵巢癌癌组织EERCCC1表达达与患者者生存期期的关系系

59、 随访时间间为285月月，平均均随访337月，生存时时间的计计算方法法为从接接受治疗疗之初到到随访结结束或者者死亡之之时。截截尾177例（336.996%），死亡亡46例例（733.044%）。Logg-raank tesst分析析表明，ERCCC1 mRNNA表达达量与患患者的生生存期相相关(PP=0.0122)，缺缺失第VVIIII外显子子变异剪剪接体的的表达量量与患者者的生存存期不存存在相关关性（PP=0.07），在总总量中去去除变异异剪接体体的量后后，ERRCC11全长mmRNAA的表达达水平与与生存期期具有更更低的PP值。患者ERRCC11 mRRNA表表达量高高低组生生存曲线线比较

60、 Logg-raank tesst 表表明，EERCCC1 mmRNAA表达的的总量TTT与全全长FLL与患者者的生存存期相关关，缺失失第VIIII外外显子的的变异剪剪接体AAS与患患者的生生存期无无关。Survvivaal ccurvve oof oovarriann caanceer ppatiientts使用Coox比例例风险模模型（CCoxs ppropporttionnal hazzardd moodell）对影影响患者者预后的的因素进进行多因因素分析析，结果果显示临临床分期期，病理理学分级级和ERRCC11 mRRNA（总量）是影响响患者预预后的因因素，而而组织学学类型和和ERCC