校内课题53项含中鲁医院总公司药学院

1、受理：山东省高校中抗协同创新中心项目可行性项目名称：紫锥菊抗活性成分及作用机制的研究项目责任：山东中大学项目：项目年限：2015 年 1 月至 2016 年 12 月填报日期：2015 年月日填写说明为建立、规范的协同创新项目信息管理制度，加强项目信息的管理，特设计山东省高校中抗协同创新中心项目可行性（申报书）格式和填写要求。一、请严格按照表中要求填写各项。二、项目可行性可以由一家组织，也可以由多家联合组织，牵头为项目组织实施的责任。每个项目只能有一家责任和一个组长。三、项目可行性由项目责任编写，并报中抗协同创新中心管理汇总；四、项目可行性中第一次出现外文名词时，要写清全称和缩写，再出现同一词

2、时可以使用缩写。五、组织机构代码是指项目责任组织机构代码证上的标识代码，它是由组织机构代码管理中心所赋予的唯一法人标识代码。六、编写应客观、填报材料，尊重他人知识，遵守国家有关知识。在项目可行性中他人研究成果时，必须以脚注或其他方式注明出处，目的应是介绍、评论与自己的研究相关的成果或说明与自己的研究相关的技术问题。对于、篡改科学数据，他人著作、或者剽窃他人科研成果等科研不端行为，一经查实，将记入信用。七、此表为项目可行性的基本信息，请务必填写正确。一、项目基本信息项目名称紫锥菊抗活性成分及作用机制研究预计完成时间2016 年 12 月预期成果类型新药责任信息名称山东中大学性质通讯地址所在地区主

3、管部门组织机构代码传真号码成立时间电子信箱项目组长信息出生日期最高学位从事专业固定移动传真号码电子信箱证件类型证件号码联合信息序号1山东中大学附属医院23项目经费来源（万元）总经费项目经费企业投资其他二、项目简介简述项目目标和内容，限 500 字以内流行 冒 ，简称流感 ，是一种造成人、狗、马、猪及禽类等患流行 冒的RNA ，在分类学上，流感 属于正 科，它会造成急性上呼吸道 ，并借由空气迅速的 ，在世界各地常会有周期性的大流行。据统计，90%以上急性呼吸道 由 引起。紫锥菊属于菊科紫锥菊属的多年生草本植物，又名紫松果菊，原产中东部和南部地区，为印地安人的民间草药。紫锥菊在西方应用广泛，用于防

4、治上呼吸道疾病如感冒、流感、皮肤病、过敏性疾病等症，是闻名世界的“免疫”草药，具有突出的抗与免疫促进作用。紫锥菊药理作用的研究表明，紫锥菊除能增强免疫力外，还具有抗炎、抗菌、抗、抗肿瘤及组织更新等药理活性。目前国外对紫锥菊药理活性的研究还局限在刺激免疫水平单方面，紫锥菊抗 作用谱和作用机制未见太多 学者关注，国内人用抗 紫锥菊制剂尚未见 ，人用药制剂还需要全面研究开发，因此有必要对紫锥菊抗 药理活性及临床应用进行深入的探讨和研究，开发抗 新药紫锥菊胶囊，为抗击不断变异的流感 和创制新型抗 药物提供理论基础，加快天然药物紫锥菊的生产研发产业的发展，最终为人类和动物的健康及自然环境的改善服务。本项

5、目以药用植物紫锥菊为研究对象，研究紫锥菊抗 活性成分及作用机制，开发紫锥菊抗 制剂，具体内容为：以抑制流感 活性为指标，通过体外、小鼠体内实验拟完成对紫锥菊不同极性部位抗流感 作用的筛选；对优势部位的活性成分定性定量分析，进一步用柱分离技术获得有效单体或者某一类物质成分；用获得的单体或某一类物质成分验证抗流感 作用，研究其抗 作用机制；开发国家新药紫锥菊新药，制定质量标准。二、项目立项的必要性分析2.1 立项的意义紫锥菊（Echinacea pupurea（L.）Moench.）属于菊科（Com itae）紫锥菊属（Echinacea）的多年生草本植物，又名紫松果菊，原产 中东部和 南部地区1

6、，为 印地安人的民间草药。紫锥菊在西方应用广泛，用于防治上呼吸道疾病如感冒、流感，皮肤病如粉刺、疖和 ,过敏性疾病如气喘，以及喉部疼痛等症2，是闻名世界的“免疫”草药，具有突出的抗 与免疫促进作用，可通过刺激机体的免疫系统而增强机体对细菌和 的抵抗力。由于其确切的疗效作用,目前在欧美广泛应用于药品、营养补充剂和 食品。20 世纪 70 年代，紫锥菊作为花卉引入我国；90 年代始国内各地作为药用植物引种。现在 怀柔、山东临沂、 安 苏 、浙江淳安、 桐城、湖南浏阳、 襄 西南昌以及 、吉林、辽宁、陕西、 、云南等多地均有引种3， 种植范围较广。流感 常为甲型流感 ，甲型流感 最容易发生变异，甲型

7、流感 的亚型则 们称为“ ”，其中 H1、H5、H7 亚型为高致病性， 、H5N1、H7N9尤为值得关注， 后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的 。近年来，现代医学对 还没有特别有效的化学药物对症治疗，化学类药物在防治 性疾病方面只起到缓冲疾病的进一步发展，不能彻底根治，从而造成许多疾病治疗越来越 ，甚至治疗无效。国内外有关抗 中药的研究日益增多,从中筛选其有效成分已成为当前抗 新药研发的一个热点。然而抗中药的研究大部分仍然处于实验阶段，且很多药物抗 的机制仍不清楚，这严重制约了临 抗 药物的发展。我国人用临 应用较多的紫锥菊制剂，是从德国进口的施保利通，主要治疗或细菌引

8、起的呼吸道 、单纯性唇疱疹、细菌性皮肤 、因放射或细胞抑制剂治疗而引起的白细胞减少症、辅助抗生素治疗严重的细菌 等。兽医临紫锥菊制剂主要治疗鸡、鸭、猪等动物的 和提高动物的免疫力。山东齐鲁动物 品 在国内率先推出了紫锥菊的 2 个制剂产品-紫锥菊注射液和可溶性粉，经过大量的临床试验和用户反馈信息表明：紫锥菊对猪的圆环 病、繁殖与呼吸综合征以及鸡的传染性法氏囊炎、传支、 型新城疫等疾病有较好的疗效4。紫锥菊主要含咖啡酸及其衍生物、多糖及糖蛋白、烷基酰胺类物质和挥发油。咖啡酸衍生物，主要包括菊苣酸（cichoric acid）、咖啡酰酒石酸（caftaricacid）、咖啡酸（caffeic ac

9、id）和绿原酸（chlorogenic acid）；多糖及糖蛋白含量最高的是菊糖；烷基酰胺类物质含有异 和 2-甲基 的脂肪酰胺类化合物主要为十二碳-2E,8F,10E/E-四烯酸异丁酰胺和紫锥菊酰胺。国外对紫锥菊药理作用的研究表明，紫锥菊除能增强免疫力外，还具有抗炎、抗菌、抗 、抗肿瘤及组织更新等药理活性。目前我国对紫锥菊药理活性的研究还局限在刺激免疫水平单方面，人用药制剂还没有全面开发。紫锥菊抗 机制、抗 种类未见太多研究，在我国人用抗 药物尚未见 。因此紫锥菊抗药理活性及临床应用的研究是紫锥菊在我国开发利用的前提。本研究以我国引种紫锥菊为研究对象，研究紫锥菊不同极性部位抗 作用活性成分及

10、作用机制，分离其抗 的有效单体或者某一类物质成分，开发抗 新药紫锥菊胶囊，扩大紫锥菊的临床应用范围，为抗击不断变异的流感 和创制新型抗 药物提供理论基础，加快天然药物紫锥菊的生产研发产业的发展。2.2 国内外研究现状和发展趋势紫锥菊国内外文献研究主要集中在紫锥菊的栽培种植、化学成分研究、药理作用研究、制剂质量控制和指标检测方面，其中药理作用主要集中在提高动物和小鼠的免疫系统调节作用及抗呼吸道 方面，国内已开发出国家一类新兽药紫锥菊口服液、散剂和 清颗粒。2.1 紫锥菊化学成分研究在紫锥菊属植物制剂的化学成分及结构研究中，分离出咖啡酸衍生物、烷酰胺化合物、多糖和糖蛋白、精油、多炔化合物、黄酮类化

11、合物等5。6从松果菊的水溶性部分中分离鉴定了 5 个苷类化合物，其中,2-（4-羟基苯基）乙基-O-L-鼠李糖基（1-6）-D-葡糖苷为新化合物，其余为首次从本属植物中分离得到；从脂溶性部位中分离鉴定了 3 个化合物，分别为 1,6-二羟基-4（14）桉叶烯、二十四酸与二十六醇，均为首次从该植物中获得7；8从挥发油部分中分离鉴定了16 个化合物，其中 9,12-十八碳二烯单甘油脂、9,12,15-十八碳三烯单甘油脂及邻苯二甲酸二丁脂 3 个化合物为首次从该属植物中分离。咖啡酸类衍生物紫锥菊地上部分及其根的乙醇提取物中含有咖啡酸类衍生物，包括菊苣酸、绿原酸、咖啡酸、紫锥菊苷、菜 和异绿原酸等，主

12、要成分为菊苣酸9。Becker 和 Hsich 首次从紫锥菊叶中分离到菊苣酸10。Soicke 等从紫锥菊叶中分离到菊苣酸甲酯以及 2-O-caffeoyl-3-O-feruloyl- ic acid 和 2,3-diferuloyl- ic acid。其后又分离出 2-O-caffeoyl- ic acid 和2-O-caffeoyl-3-cumaroyl- ic acid。紫锥菊花中富含菊苣酸，含量为 1.2 1.3，小舌片中含量最高，叶片和茎中较少。其含量与季节和生长期有关，植物在营养期开始时含量最高，到植物生长期含量降低。生长期含量降低。传统酊剂时，在浸泡过程中菊苣酸降解。紫锥菊地上部

13、分用 50的乙醇浸泡 5d，在浸泡过程中发现菊苣酸的含量急剧降低。但在浸泡 1d 后，除去植物材料，菊苣酸却很稳定，由此可见紫锥菊在提取过程中进行了酶降解。烷酰胺化合物从紫锥菊根中得到 11 种脂肪酰胺类化合物，为 2，4-双烯,十二碳 2-E，4E， 8Z-10E/Z 四烯酸异丁酰胺的同分异构体的混合物11。紫锥菊的地上部分含有二烯型的烷酰胺化合物，主要组分为 dodeca-2E，4E，8Z，10E(Z)-tetraenoic acid isobutylamide，还有较少量的 dodeca-2E,4E-dienoic acid isobutylamide 和 undeca-2E,4E-di

14、en-8,10-diynoic avid isobutylamide。紫锥菊地上部分含烷酰胺化合物 0.0010.03，且含量随季节而变化。在营养期开始时含量很低，到八月中旬含量增高。植物不同的部位含量也不一样，烷酰胺化合物通常积聚在顶部。特别是在小管型花和瘦果中。因此选择合适的采收期和收获方式十分重要，采收后应随即处理。多糖对紫锥菊地上部分的水提取物进行系统分离及相应的药理活性测试，得到 2 种免疫刺激性的多糖 PS I 和 Ps II。结构分析证明 PS I 为 4-甲氧基-葡萄糖醛-阿拉-木聚糖聚糖(相对分子质量 35 000)，Ps II 为酸性糖-鼠李糖-半乳糖聚糖(相对分子质量 5

15、0 000)12。从紫锥菊叶和茎叶分离一种 Mr 为 79 500 的木糖葡萄糖聚糖(xyloglucan)，从压出的汁液中得到类果胶多糖13 。Egert 等14从狭叶紫锥菊和紫锥菊根中分离到 3 个糖蛋白，Mr 分别为 17 000，21 000，和 30 000，约含蛋白质 3，其中主要的糖为 糖(6484)、半乳糖(1.9-5.3)及葡糖胺 (6)。蛋白质部分主要含有天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸及丙氨酸。黄酮类化合物和花色苷紫锥菊的叶、茎中含有多种黄酮类化合物，其中芦丁苷含量最高，紫锥菊中总黄酮类含量为 0.48。精油紫锥菊根中含 0.2的精油，花与叶为 0.6。精油的成份主要为：烯、律草

16、烯 、烯 环 氧 化 物 、 doceca-2,4-diene-1-yl-isova 、 pentadeca-8z ， 13z-dien-11-yn-2-one、棕榈酸、亚油酸、pentadeca-1，8z-diene、1-pentadecene、 pentadeca-8z，13z-dien-1l-yn-2-one、penta-8z-en-2-one。地上部分精油中含冰片，醋酸冰片酯、Pentade.Ca-8-ell-2-one、大根香叶烯 D、烯、烯环氧化物和棕榈酸。开花时地上部分精油含量低于 0.1%。紫锥菊的药理作用研究紫锥菊主要用于促进机体的免疫功能以及对抗各种。关于其药效研究有相当多

17、的文献,多数研究是关于德国 Madaus 公司的产品 Echinacin,该产品来自于紫花松果菊地上部分的新鲜压榨汁。15对松果菊地上部分的 50%（体积分数）乙醇提取物进行了系统的药效学研究，结果证明松果菊具有抗炎、抗菌、抗作用和增强细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能作用。紫锥菊抗作用研究国外对紫锥菊抗 作用的研究中，Wacker16采用小鼠 L-929 细胞培养的方法证实了松果菊提取物具有间接的抗流感 、疱疹 与水泡性口炎 的活性； May17发现松果菊的水提取物对流感 、疱疹 与脊髓灰质炎 具有明显的抑制作用。国内对紫锥菊抗 作用的研究还处在起步阶段，大部分文献显示，目前研究的重点在

18、抗 方面，国内已成功开发出国家 抗鸡新城疫 的一类新药。研究松果菊，已证明提取物对流感、B 族、呼吸道合胞与疱疹具有不同程度的抑制作用。松果菊对 CoxB3、CoxB5、RSV、HSV-2 引起的细胞病变有一定程度的抑制作用，有效浓度为生药 31.25g/L；对流感 有明显的抑制作用，有效浓度为生药 7.81g/L。松果菊对 Ard3、Ard7、副流感、ECHO11及 HSV-1 等引起的细胞病变无明显的抑制作用。观察松果菊对流感所致小鼠的抑制作用，结果显示，松果菊生药 20、10、5 g/L2 次，连续 5d 给小鼠灌胃，可明显降低肺部炎症，肺指数较对照组明显减轻，说明松果菊对流感病毒所致小

19、鼠具有明显的抑制作用。紫锥菊对 的免疫调节作用研究19等采用 种小鼠研究了引种紫锥菊主要活性部位的免疫调节作用。评价了引种紫锥菊多糖、咖啡酸、烷酰胺三类成分的免疫调节作用，同时比较引种与进口紫锥菊免疫调节作用的异同。结果引种紫锥菊多糖、咖啡酸、烷酰胺三类成分均能增强 A 刺激的正常小鼠脾淋巴细胞增殖，三类成分对脾淋巴细胞产生 IFN-C 也 一定的促进作用，但对 IL-2 的生成，咖啡酸类成分显示较强的抑制作用。引种紫锥菊在促淋巴细胞增殖方面与进口紫锥菊相同，但促 IFN-C 生成作用强于进口紫锥菊，而促 IL-2 作用不及进口紫锥菊。表明引种紫锥菊及其主要成分的免疫促进作用与进口紫锥菊相当，

20、可作为进口紫锥菊替代品进行相关开发利用研究。紫锥菊抗炎作用研究紫锥菊具有显著的抗炎作用。挥发油各剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用，挥发油各剂量组对蛋清致大鼠足肿胀均有不同程度的抑制作用，国内外对紫锥菊调节增强免疫系统的研究很多，免疫力的调节主要表现在细胞免疫和体液免疫方面。See 在 K562 细胞模型中证实松果菊的新鲜提取物能明显提高人的 NK(自然细胞)的 功能。吴江涛18研了究紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响，结果显示紫锥菊提取物对正常小鼠的单核巨噬细胞系统功能都没有显著影响，但可增强小鼠抵抗氢化可的松引起的免疫抑制作用，说明该引种的紫锥菊有可能成为我国的一种

21、新的药用植物资源，其氯仿提取物有可能被开发成一种免疫恢复剂 。能够明显降低足肿胀度，紫花松果菊挥发油对急性炎症引起的肿胀、渗出有一定的抑制作用。紫锥菊的多酚、多糖及异丁酞胺部分于离体或在体的模型上均呈现抗炎活性。机理为抑制透明质酸酶，减少炎症细胞的浸润，抑制环加氧酶，阻断素的 ，现代药理研究也证明其可以 病原体的 。2.2.4 紫锥菊抗菌作用研究紫锥菊的活性成分能抑制透明质酸酶的活性，从而阻碍细菌表面的受体20。活性成分多糖和咖啡酸有弱的抗菌活性。Stimal M 等21用紫锥菊多糖处理白色念球菌的小鼠，24h 后小鼠肾脏内的念球菌明显减少，表明紫锥菊多糖可抗御念球菌的；在分离试验中，发现多糖

22、可提高致死量念球菌小鼠的存活率。松果菊根的多聚炔组分在体外试验中对绿脓假单胞菌与杆菌具有明显的抑制作用。参考文献：1 McGregor R L.The taxonomy of tus Echinacea（Comtae）J.Univ Kansas Sci Bull，1968，48：1-13.2,.欧美药用植物(一)J.中国野生植物资源，2003，22（3）：56-57.3 韩,.我国引种药用植物紫锥菊研究进展J. 中华中学刊,2012,30(8):1799-1801.4 陈,禚宝山,. 神奇的“免疫植物”紫锥菊J. 饲料研究,2005,10:28-30.5.紫锥菊届植物制剂的化学、免疫作用与临床

23、J.国外植物药分册,200l,16(2):47.6，王邠，.紫花松果菊水溶性成分研究 J.药学学报，2002,37：121-123.，高秀峰，.紫花松果菊亲脂性成分研究J.中国中药杂志，2002,27:40-41.，侯建中，. 松果菊挥发油的化学成分研究J.药信息杂志，2002,9:42-43.9Bauer R，Remig.TLC and HPLCysis of caffeic acidJ.Planta Med，1989， 55：660.Becket H,H sieh W，Chichore acid and its derivativers from Echinacea speciesJZ N

24、aturfo rsch，C：Biosci，1985，40c(728)：5852-5921Bauer R,Rein ig,H Wagner et a1.Alides from the roots of Echinacea purpureaJ.Phytochemistry,1988,27:23392-23421.Stuppner H，An immunestimulating active principle from Echinacea purpureaMoenckJ.Z Angew Phytother,1981,2(5):1662-1740.Esert D,Beuscher N.Studies

25、on pecifity of immuno reactive arabinogalactan proteins extracted from Baptisiatinctonia and Echinacea purpureaJ.Planta M,1992， 58:1632-1651.Bayer R. tent of echinaeoside in Echlnacea roots of different originJ.Beitr Zuechtungstorsch,1996,2(1):642-671.,. 松果菊属药用植物的应用基础研究J.学报(医学版）,2004,36(1):90-93.Wac

26、ker A,Hilbig W.hemmung mit Echinacea purpureaJ.Planta Medica,1978,33:89-102.May G,Willuhn G.Antivirale wirkung wrigflanzenextrakte ingewebekulturenJ.Arzneimit-Forscg/Drug Research,1978,28:1-7.吴江涛,.紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响J.烟台大学学报(自然科学与工程版)2001,(14)131-134,.引种紫锥菊主要活性部位的免疫调节作用研究J.国医国药,2009,20(4):970-972

27、.Roger A,Burger, Anthony R,etc. Echinacea-induced cytokine production by human macrophagesJ.J.Immunopharmacol 1997,19(7):371-379.Stimel M,Proksch A,Wagner H,et al.Macrophage activation and induction of macrophase cytotoxicity by purified polysaccharide fractions from the planr Echinacea purpurea. In

28、fection and Immunity . 1984,46(3):845-854.三、项目内容和研究方案研究目标和考核指标本项目主要针对呼吸道 如流感 、副流感 等危害人类健康的常见多发的 ，研究紫锥菊在抗 方面的药理作用及活性成分的追踪和提取，研制紫锥菊抗 新药， 创制具有 知识 、疗效好、副作用小、市场前景大的化学药。截至 2016 年 12 月前，项目须完成紫锥菊抗 活性成分基础理论和新药开发的研究。具体研究目标如下：收集与鉴定紫锥菊样品紫锥菊的地上部分和根及根茎，对实验样品进行性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等方法，保证紫锥菊研究样品的准确性、一致性和科学性。将紫锥菊的地上部分和根及根茎

29、分别 ，过 20 目筛，备用。不同极性部位紫锥菊样品设计一系列（水、甲醇、浓度不同的乙醇、 、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚）极性梯度的溶剂，根据样品所含化学成分极性的不同分别提取、过滤、精制，得到不同极性部位紫锥菊样品。筛选具有抗 作用的不同极性部位的紫锥菊样品本实验利用紫锥菊不同极性部位对流感 进行体外和体内两方面的试验研究，采用 MDCK- 模型 活性成分，根据抑毒指数确定紫锥菊抗流感的优势部位；采用小鼠-流感 肺适应株模型，评价活性部位体内抗 效果。精制紫锥菊有效部位的活性成分由活性部位运用色谱技术方法检测有效部位的化学组成，确定色谱峰的归属，用柱层析分离技术获取活性成分。探讨紫锥菊活性成

30、分的抗流感作用机制研究含有活性成分的样品抗流感的作用机制，判断样品对作用机理是下列哪种途径：阻断机制、抑制机制、关键酶抑制机制、对小鼠的免疫系统影响，计算各组间的抑毒指数、荧光定量 PCR 方法、探讨活性部位对神经氨酸酶、RNA 聚合酶、转录酶有抑制活性、小鼠脾脏指数、小鼠GLO 和 IgG 水指标。3.1.6 抗 中药紫锥菊新药通过对有效部位抗 作用的筛选、活性成分的 和活性成分作用机制的研究，将有效活性成分提取、精制， 适宜紫锥菊制剂，开发紫锥菊抗 新药，制定紫锥菊抗 新药的质量标准。研究内容、研究方案样品收集与鉴定紫锥菊的地上部分和根及根茎，对实验样品进行常规的性状、显微、理化等方法鉴别

31、紫锥菊样品，保证样品的准确性。将紫锥菊的地上部分和根及根茎分别，过 20 目筛，备用。不同极性部位的提取本实验分别以水、甲醇、乙醇(25，50，75，90)、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚为溶剂，提取、过滤，滤液做流感实验。紫锥菊不同极性部位提取物的：药材粗粉 200 g，置烧瓶中，加入 8 倍量的石油醚（6090 ）回流提取三次，每次 1 h，滤过，滤液减压（60，0.1 MPa）回收溶剂，真空干燥（60，0.1 MPa），备用；药渣挥净溶剂，依次换用三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、水等溶剂替换石油醚重复上述工艺步骤，紫锥菊不同极性部位提取物（水提取物浓缩至 1 g/ml 的溶液，即得）。紫锥菊粗提物

32、的：取紫锥花药材粗粉 25 g，置烧瓶中，加入 8 倍量的 50%乙醇回流提前三次，每次 1 h，滤过，滤液减压（60，0.1 MPa）回收溶剂至少量，加水稀释至 0.5 g/ml 的溶液，即得。不同极性部位体外抗的研究体外试验首先建外模型, 采用细胞病变法（CPE）、鸡胚法观察各部位对流感细胞的保护作用。通过先后加药、先加药后、同时加药三种给药方式,判断紫锥菊有效部位抗流感是直接作用还是间接作用。细胞病变法(CPE)法增殖将流感接种于 MDCK 细胞上，加 DMEM 培养液后置 37 、5%CO2 条件下培养，在 96 h（出现 90%以上的病变）后，反复冻融 3 次，吹打离心，取上清液定量

33、分装，- 80 冰箱冻存备用。对 MDCK 细胞的毒力测定将流感用 DMEM 维持液做 10 倍比系列稀释，纵向重复 3 孔，横向依次接种于 96中已长成单层的 MDCK 细胞上，同时设正常细胞对照。37 、5%CO2 培养，倒置显微镜下观察，4896 h 后细胞病变（CPE）百分率。应用 Reed-Muench方法的公式计算组织半数浓度（TCID50），并确定最大不浓度（TCID0）。药物毒性将药物用 DMEM 细胞维持液作 110、120、140、180、1160、1320、 1640、11 280、12 560 稀释，接种于 96中已经长成单层的 MDCK 细胞上，共做 3 个培养板进行

34、重复实验。37 、5%CO2 培养，观察细胞病变，连续 7 d 观察药物毒性，细胞出现病变者判为药物毒性，细胞病变（CPE）百分率，应用 Reed-Muench 方法计算药物半数浓度（TC50），并确定最小无毒浓度（TC0）。药物抑制流感实验将实验药物用 DMEM 细胞维持液从最大无毒浓度开始分别作 2 倍系列稀释共 9个稀释度，按稀释度顺序以每孔 100 l 的量横向接种于 96 板孔中的单层细胞上，每孔再加入 100 TCID50 的流感 100 l）（流感 先加入终浓度为 2 g/ml 胰酶作用约 2 h），同时设 林阳性对照组、 对照组及细胞对照组，共做 3 个培养板进行重复实验。37

35、、5%CO2 培养， 观察病变，连续观察 96 h。 对照组出现 90%以上的病变后， 细胞病变（CPE）百分率。应用 Reed-Muench 方法计算药物半数有效浓度（EC50），将 TC50 除以 EC50 为抑毒指数（TI）。将各组 TI 相比较，寻找紫锥菊抗流感 有效部位。含药 对流感 的抑制作用从含药或空白 2 倍最大无毒浓度开始 2 倍梯度稀释成不同浓度，将以上不同浓度的含药 与 等体积混合，于 36.5、5%作用 1h，待 96 每孔细胞长成薄单层后，倾去原有生长液，液轻柔洗细胞 2 次; 加入含药 - 混合液，培养箱中培养，采用血凝试验和 MTT 法检测含药 对流感 的直接 作

36、用。3.2.3.2 鸡胚法3.2.3.2.1 药物对鸡胚半数 量(EID50)测定将鸡胚在 39下孵育至 10d 胚龄，于尿囊腔分别接种。甲型和乙型流感，接种量为 0.1ml/胚，每组实验均接种 5 枚鸡胚。室温放置 lh 后，对照组尿囊腔给予生理盐水 0.2ml，实验组分别给予紫锥菊各极性组 0.2ml，阳性对照组给予利0.2m/胚。石蜡 ，置孵箱内孵化，48h 后将鸡胚置冰箱内 2h，收获尿囊液，进行血凝实验。釆用 Reed-Muench 法计算流感 对鸡胚的半数 量(EID50)值。药物对鸡胚毒性的测定分别采用尿囊腔及卵黄囊两种途径,将各稀释度的药液注入鸡胚,每组 5 枚鸡胚,每胚注入药

37、量为 0.1ml。同时设 DMSO 组,亦釆用尿囊腔及卵黄囊两种途径注入 DMSO溶液 0.1ml/胚。观察指标:鸡胚经 37恒温培养箱辉育 72h,观察鸡胚的存活情况,以鸡胚全部存活的最高药物浓度组浓度作为药物对鸡胚的最大无毒浓度(TCo)。药物鸡胚内抗流感 增殖作用测定将 20EID50 的流感 液 0.1ml,经尿囊腔注射接种于鸡胚中。根据药物对鸡胚的毒性测定结果,选择药物的最大无毒浓度为高剂量组、用 DMSO 溶液对倍稀释后设为中、低剂量组。每组 10 枚鸡胚,每胚药物注射量均为 0.1ml。通过尿囊腔及卵黄囊两种途径,预防和治疗 2 种方式将药物注入接种流感 的鸡胚中。预防给药的方式

38、为预先注入药物于鸡胚中,37孵育 1h,再接种 液；治疗给药方式为预先将 液接种于鸡胚中,37孵育 1h 后,再将不同剂量组药物注入鸡胚中。分别设置空白对照组、 对照组、。空白对照组不接种 液,每胚按照与药物同样的方式注入生理盐水溶液 O.lml 对照组鸡胚在接种 后按照药物同样的方式注入 DMSO 溶液 0.1ml；亦按照药物同样的方式注入最大无毒浓度的 林溶液溶液 O.lml。鸡胚经 37恒温培养箱孵育,观察鸡胚的存活情况,72 后收集尿囊液测定血凝滴度。不同极性部位体内抗 的研究根据体外筛选，选取 2 个极性部位进行体内实验。首先验证紫锥菊对小鼠的毒性,确定无毒浓度。然后对小鼠进行攻毒,

39、通过对小鼠的 率、平均存活天数、平均体重,肺指数、肺病变抑制率等指标进行检测。3.2.4.1 流感 半数致死量的测定将收集的流感 原液(鸡胚尿囊液)10 倍倍比稀释，得到 10-1、10-2、10-3、 10-4、10-5 浓度的 液。取 种小鼠 50 只，用单纯随机抽样法随机平均分成 5组，每只小鼠经乙醚轻度麻醉后分别滴鼻 不同稀释度 液 0.05 mL，以 和生存为观察指标，24 h 内 的不予统计。每天观察，直至 后第 14 天为止。计算出 的半数致死量(LD50)。药物对流感 半数致死量(LD50)的测定将药物用 0.5%吐温-80 溶液依次稀释 2.5 倍、5 倍、10 倍、20 倍

40、、40 倍 5 个浓度组(为方便实验进行,实验浓度表示根据含量转换为 40%、20%、10%、5%、2.5%,最后结果剂量再转换为 ml/kg 体重)。实验前禁食(不禁水) 12 小时,单次灌胃给药,灌胃剂量按照 0.2ml/10g 体重,密切观察给药后 3 小时内小鼠的症状及情 况,并观察给药后 14 天内小鼠的生存状态及情况。根据 Bliss 法以给药剂量、动物数及总数,计算出各药物对小鼠的 LD50 值,及 LD50 的 95% 区间。药物对甲型流感小鼠保护的作用研究方法：以乙醚轻度麻醉小鼠后，A 组及 F 组以生理盐水滴鼻，每只 50ul。其余各组以 50ul 株的 液滴鼻， 量为 2

41、5 LD50。给药方法： 4 小时后给小鼠灌胃给药，各组浓度如上表所述，O.2 mL次，每天 2 次，连续 5d，正常空白组、 模型组灌服生理盐水 0.2 mL。观察项目：逐日观察动物发病症状，记录 时间， 数，共观察 14 天，按下式计算结果：保护率()=( 模型组 率实验组 率) 模型组 数100延长生命率()=(试验组日均存活数模型组日均存活数)模型组日均存活数100。药物对性模型小鼠肺指数的影响，药物对性模型小鼠肺组织血凝滴度的影响，药物对性模型小鼠肺组织病理形态学的影响。紫锥菊有效部位活性成分的确定当确定有效部位后，锁定该部位进行精制、分离、定性定量及结构式测定。有效部位的：设计正交

42、试验，以出膏率和有效成分含量为指标优选工艺参数。采用柱层析分离技术，分离精制有效部位，联合高效液相色谱-质谱联用技术 、获取活性成分。3.2.5.2 有效部位中主要活性成分和结构式的确定：运用高效液相色谱-质谱联用技术进行定性定量，确定活性部位中化学成分的组成和分子结构式，最终获得具有抗活性的单体或一类物质。紫锥菊活性成分抗流感作用机制的研究阻断 机制的研究将具有抗 活性的单体或一类物质与 作用 1h 后再接种 MDCK 作为组，同时设有与 同时接种 MDCK 细胞的实验对照作为组、细胞对照、 对照、药物毒性对照。35、5% 培养 96h 后，计算、组间抑毒指数。如果组抑毒指数大于组，则提示受

43、试样品的抗 机制与阻断 机制相关。抑制 机制的研究采用荧光定量 PCR 方法。根据 8 个片段设计引物，通过荧光定量检测，探讨 过程是否受到限制。3.2.6.3 关键酶抑制机制的探讨采用商品试剂盒，探讨活性部位是否对神经氨酸酶、RNA 聚合酶、转录酶有抑制活性。紫锥菊有效部位对 小鼠的免疫系统影响的研究设计不同剂量灌喂小鼠具有抗 活性的单体或一类物质 15d,以研究紫锥菊提取物对小鼠免疫功能的影响。检测指标为：小鼠脾脏指数、小鼠 GLO 和 IgG 水平、小鼠 CHOL 水平、试验组小鼠的 时间极与对照组比较，RANTES 水平的测定，IFN- 水平的测定，IL-6 水平的测定，IP-10 水

44、平的测定，MIP-1 水平的测定。紫锥菊抗 新药的通过对有效部位抗 作用的筛选、活性成分的 和活性成分作用机制的研究，将有效活性成分提取、精制，获得具有抗 活性的单体或一类物质， 适宜紫锥菊制剂，开发紫锥菊抗 新药，制定紫锥菊抗 新药的质量标准。紫锥菊抗 新药的优化提取、分离、精制工艺，优选工艺路线，根据活性成分的物理化学性质，选择适宜的剂型，紫锥菊抗新药。3.2.7.2 紫锥菊抗新药质量标准的制定制定的紫锥菊抗新药质量标准应稳定、可控,便于操作和质量控制，既保持传统特色，又应用了现代先进检测技术。项目预期解决的关键问题本实验完成我国引种紫锥菊从品种鉴别、抗流感药效学、抗流感物质成分、作用机制

45、到紫锥菊抗新药的探索，拟解决的关键问题如下。研究紫锥菊的不同极性部位体外、体内抗流感作用，完成紫锥菊不同极性部位抗流感的效力评价研究；对紫锥菊抗流感活性部位分离精制及测定化学成分及结构式，完成紫锥菊抗作用机制的研究；完成紫锥菊抗新药的研制及质量标准的制定。3.4 项目年度任务和考核指标年度年度任务年度考核指标重要任务的时间节点2015文献调研、实验方案的设计、实验材料的收集和整理开始紫锥菊的各极性部位提取样品的体外抗预实验；开始紫锥菊各极性部位的体外抗实验和体内抗实验；紫锥菊有效部位活性成分的精制和分子结构式的研究；开始紫锥菊活性成分抗流感作用机制的研究开始紫锥菊抗 的活性成分的定位、分离、精

46、制；开始活性成分抗 作用机制的研究2015.122016紫锥菊抗新药的研制；紫锥菊抗新药的质量标准；完成资料的整理和撰写完成紫锥菊活性成分抗流感 作用机制的研究；完成紫锥菊抗 新药的研制和质量标准的制定；完成资料的整理和撰写2016.123.4 联合任务分工情况注：可根据内容自行调整任务名称联合任务负责人目标研究内容考核指标重要任务的时间节点建议经费（万元）紫锥菊抗活性成分及作用机制的研究山东中医药大学完成紫锥菊抗理 论基础及新药的开发完成紫锥菊抗理 论基础及新药的开发完成紫锥菊抗理论基础及新药的开发2016.1230四、项目技术路线、知识对策及市场分析项目技术路线及其先进性和可行性分析（说明

47、其主要技术创新点）技术路线基源鉴别样品的收集与鉴定显微鉴别性状鉴别各极性部位样品的细鸡体胞胚内培法抗养实病实验毒验实验抗活性成分的精制紫锥菊活性成分抗流感作用机制的研究阻的 抑制 病断研 制的 毒入究 病探 关侵机毒讨 键制复酶的制抑研机制究制机紫锥菊抗新药的极性部位抗作用的筛选4.1.2 项目先进性本研究首次从细胞培养、鸡胚、整体动物三个方面全面的了紫锥菊不同极性部位抗效应,结果更为可靠;首次有机结合免疫学、学、分子生物学和分子药理学等学科的相关研究方法与技术,探讨紫锥菊有效部位抗流感的相关机制。全面、深入地揭示紫锥菊清热解毒的现代科学内涵,为紫锥菊的现代研究提供了新的方向。4.1.2.1

48、本课题首次同时系统研究国产引种紫锥菊的抗作用。4.1.2.2 本课题首次系统研究比较紫锥菊的不同极性部位抗流感的效力。4.1.2.3 本课题首次系统研究紫锥菊的不同极性部位体外、体内抗流感作用。4.1.2.4 本课题首次系统研究紫锥菊抗流感的作用机制。4.1.2.5 本课题首次研究紫锥菊抗流感的有效部位及该部位的化学成分及结构式。4.2 知识和技术标准分析及对策（含国内、国际竞争力分析）本项目研究中所应用新技术均依照我国知识领域严格实施，不存在与其他国内外任何个人和的知识纠纷。由于紫锥菊在我国药用历史不长， 对紫锥菊的抗理论研究处在初期阶段，多数研究局限于兽药抗的药理和提高免疫力机制的研究，本

49、项目主要研究紫锥菊抗流感的活性成分及作用机制的研究，在国内比较有创新性和竞争力。国外文献显示，紫锥菊中具有抗流感、单纯疱疹和鼻的活性，其作用机制的研究可能跟提高免疫力、抑制诱导的多种细胞因子如人支气管上皮细胞(BEAS-2B)和另外两个人类细胞系，来降低对的危害、减轻感冒症状。但这些研究还以解释说明紫锥菊抗的机理。本研究有望完善紫锥菊抗活性成分和作用机制研究，为研制抗新药提供理论基础，并开发一种紫锥菊抗新药，制定新药的质量标准，该产品作用靶点更加清楚，副作用比传统化学药品小，而疗效更加显著。待该产品获得新药和生产批文后，质量技术标准将成为。4.3 预期产品的市场分析或技术成果应用分析流行冒（i

50、nfluenza，简称流感）有甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，引起人和动物（猪、马、海洋哺乳动物和禽类等）流行冒（简称流感。其中 1934 年分离出的甲型流感在引起人类流感流行上最为重要，是反复流行最为频繁和引起真正全球流行的重要病原体。现在，甲型流感一直是世界各国长期密切监视的之一，流感的预防和治疗给人们带来沉重的经济负担。抗 化学药物常具有耐药性和副作用的的缺点，且目前尚无特效治疗药物，从天然药物中寻找高效低毒的先导化合物是发现并研制抗流感药物的一条有效途径。本项目旨在从天然植物中研究抗 活性成分并开发抗 新药，以抗击不断变异的流感 。本项目开发的抗 新产品属于天然药物，抗流感 并且提高

51、机体免疫力，疗效高副作用小，因此，本品具有广阔的应用前景。一旦研发成功，不但将给广大的感冒患者提供一种疗效佳，副作用小的药品，减轻患者的痛苦，造福社会，而且产生巨大的经济效益。五、基础条件和优势项目责任和联合、团队的基本情况（包括与项目实施相关的实力和基础，以往的业绩和成就，承担相关项目情况）本项目前期工作基础扎实、全面，已累积了相当多的研究经验，成员搭配合理，理论素质和操作技能较全面，设备仪器先进，为本项目的实施提供有力保障。与本研究有关的研究工作积累和工作基础该项目前期研究已基本上完成了的分类、分离和鉴定，初步进行了紫锥菊等抗中草药的筛选，已完成紫锥菊药材的生态环境、生长特征、组织特征、药

52、材性状等研究，提取得到的活性成分较传统方式提取纯度高出 20%，提取率提高 30%。本项目前期工作成绩如下：已情况表 1已情况专利申请情况表表 2专利申请情况表序号专利名称时间专利类型1一种紫锥菊的超微粉散剂及其方法和应用2012.06.13发明专利2一种紫锥菊提取物散剂及其方法和应用2011.09.07发明专利3一种紫锥菊口服液及其方法和应用2011.10.26发明专利4一种复方抗鸡大肠杆菌兽药制剂2012.06.13发明专利5一种治疗肝炎的药物及工艺2011.11.30发明专利序号杂志1紫锥菊中菊苣酸的提取工艺和含量测定中国实验方剂学杂志2010，16（4）：1-32不同紫锥菊提取物对肉仔

53、鸡免疫功能影响中兽医杂志2010，29（2）：7-113超声波法提取紫锥菊中菊苣酸的工艺优化研究中国兽药杂志2010，44（5）：35-376一种用于治疗鸡大肠杆菌病的中药组合物2014.04.09发明专利7一种治疗仔猪白痢的中药复方连翁止痢散及其制备方法和应用2014.04.09发明专利5.1. 获奖成果情况表表获奖成果情况表序号成果名称完成时间评奖获奖奖项1新城疫综合防控技术推广应用2013山东省人民政府山东省科技进步奖二等奖2新型动物用天然植物药关键技术开发与畜禽健康养殖示范2013青岛市科技局青岛市科技进步一等奖5.1 已完成和正在承担的其他项目情况表科研项目一览表序号项目名称项目来源

54、项目性质起止时间1紫锥菊有效部位新兽药防治畜禽病的研制开发国家科技部十二五项目2011.1-2015.122新型安全防治畜禽性疾病的纯中药制剂的中试与示范国家财政部地方特色产业项目2012.1-2013.123优质畜禽高效健康养殖及疫病防控技术集成与示范国家科技部星火计划2013.1-2014.124紫锥菊活性成分高纯度提取物及其制剂研究青岛市科技局青岛市中小企业培育滚动支持2010.1-2012.125国家一类新兽药紫锥菊原药材及其制剂项目青岛市经信委青岛市技改贴息项目2013.3-2015.35.1 项目组情况博士2 名，5 名。项目一直从事中药质量控制的研究和理论教学工作，具有教授高级、

55、身为博士、博士生导师，主持参与多项“973”、国家级、课题，并能协调项目组的各项工作，保证项目顺利进行。项目组成员有丰富的理论和实践经验，阶梯合理，老中青搭配得当，并带有在读项目组实验设备本项目前期研究获得山东省高等学校中 抗 协同创新中心资助项目支持，获得财政拨款以及相关政策扶植，在经费和政策上保障了前期研究工作的顺利开展。本课题依托山东省医学 医学 学 ，拥有先进的 学研究和仪器设备，如荧光倒置显微镜、CO2 培养箱、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、超薄切片机、核酸 及分析系统等。本课题依托国家中 管理局“中药质量分析”三级 、山东省高校重点实验室“天然药物研究 ”，有中药提取浓缩机组、 费休式水分仪、紫外分光光度计、组织匀浆机、纯水系统、液相色谱、微量移液器、旋转蒸发仪、生物显微镜等。 仪器设备配套、实验条件完善，可以满足本课题研究的需要。