临床免疫学和免疫检验2015讲义固相膜

1、第十二章 固相膜免疫测定第一节第二节第三节概述免疫金标记技术膜载体免疫测定的种类与原理第一节 概述固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。标志物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒。一、常用的固相膜固相膜免疫测定中常用的膜为玻璃素（fiberglass）膜、尼龙（nylon）膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和硝酸素（NC）膜等。其中最常用为 NC 膜。二、固相膜的技术要求孔径流速蛋白质结合力均一性第二节 免疫金标记技术免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合

2、处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量的快速免疫检测。时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量一、胶体金的（一）原理胶体金的一般采用还原法，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素 C、白磷、硼氢化钠等。（二）技术要点枸橼酸三钠还原备金溶胶，如此的金溶胶其可见光区最高吸收峰在 535nm。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。（三）注意事项玻璃容器的清洁玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过强酸洗，后硅化。试剂、水质和环境氯金酸极易吸潮，对金属有可稳定数

3、月不变，实验用水一般腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其 1%水溶液在 4蒸馏水，中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。二、免疫金的（一）原理免疫金是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物，在免疫组织化学技术中，上称之为金探针。原理为蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。（二）技术要点胶体金溶液的蛋白质最适标记量（三）注意事项多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG 和 BSA 是最常用的稳定剂。第三节 膜载体免疫测定的种类与原理一、免疫渗滤试验免疫渗滤试验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。用于检测尿液 HCG 的“金标

4、”早孕试剂也已广泛应用。（一）原理斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸素膜上的相应抗体或抗生反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的，同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，简化了操作步骤，成为床边检验（POCT）的主要方法之一。（二）方法类型1.双抗体夹心法测抗原用抗体结合在微

5、孔滤膜，滴加待检标本，若标本中为待测抗原则与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜2.间接法测特异性抗体呈红色斑点（胶体金）。用抗原在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜呈红色斑点（胶体金）。该法由于标本中非目的 IgG 的干扰，易导致假阳性结果，临较少用。（三）实验材料滴金反应板胶体金标志物洗涤液抗原参照品或抗体阳性对照品（四）技术要点上样滴加胶体金标记抗体滴加洗涤液 23 滴结果观察 在膜有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。二、免疫层析试验（一）原理金免疫层析试验是

6、用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。（二）方法类型双抗体夹心法测抗原竞争法测小分子抗原3.间接法测抗体 为了消除待测标本中大量的非特异性 IgG 与特异性 IgG 竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。（三）实验材料临有现成试剂盒供应，试剂盒主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一试剂条上，试剂条的底板为单面胶两端粘贴吸水性强的滤纸等材料。（四）技术要点片，层析条为多孔聚乙烯、硝酸素、玻璃素材料，A、B将试剂条标记线一端浸入待测标本中 25 秒或在标本加样处加一定量待检标本

7、，平放于水平桌面上。在 520 分钟内观察结果。结果判断。为出现 1 条棕红线质控条带；阳性为出现 2 条棕红线条带；无棕红线条带出现为试剂失效。（五）临床应用1.正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及类药物等）。2.正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG 等）的检测。三、斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验（DoISA）的实验原理与常规的 ELISA 相同，不同之处在于斑点-ELISA 所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近 100%）的硝酸NC 染色。素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使实验方法为：加少量（12l）抗原于膜上，由于 NC 膜吸附能力强，故需在

8、干燥后进行封闭；然后滴加样品，其中的待检抗体即与 NC 膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如 HRP 标志物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。优点为：NC 膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通 ELISA 高 68 倍；试剂用量较 ELISA 节约约 10 倍；操作简单，实验及结果判断不需特殊设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的 NC膜可长期保存（20可长达 6 个月），不影响其活性。四、酶联免疫斑点试验体外检测特异性抗体（一）ELISPOT 原理B 细胞和细胞因子T 细胞的酶联免疫斑点试验（ELISPOT）

9、细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIPNBT 底物孵育后，PVDF 膜出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。（二）ELISPOT 特点1.ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。2.ELISPOT 通过显色反应，在细胞这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过 ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表 1 个细胞，从而计

10、算出蛋白的细胞的频率。该由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从 20 万30 万个细胞中检出该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素 McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细1 个胞细胞因子。ELISPOT 技术应用领域非常广泛，如移植中排斥反应的、发展、Th1Th2 分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、筛选等。性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的五、免疫印迹法（一）原理1.抗体的性质 影响免疫印迹成败的一个主要是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数

11、多克隆抗免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在第一阶段为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。抗原等蛋白样品经 SDS 处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸素膜（相当于了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的 HRP 底物为 3，3，-二氨基联苯胺（呈棕色）和 4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据 SDS时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。（二）免疫印迹中需要注意1.抗体的性质 影响免疫印迹成败的一个主要是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数多克隆抗免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。2、IBT 的灵敏度3、IBT 法在临床中的应用中或多或少地