实验动物学汇总遗传工程动物

1、遗传工程动物 管敏强实验动物中心 主 要 内 容第一 转基因动物第二 基因敲除动物一.转基因动物 概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。特点：分子及细胞水平的操作，组织和整体水平的表达。目的：培育新种，获取人类所需的生物产品，或进行基因功能的研究。转基因动物研究大事记1.追溯20世纪60年代末和70年代初就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能不能在动物卵细胞和早期胚胎中翻译。 2. 1974年，Jaenisch和Mintz首次报道应用显微注射法获得SV40DNA转基因小鼠。 3.1982年Palmiter成功获得了含金属巯基(MTI)基因启动子

2、与大鼠生长基因的融合基因的转基因小鼠。体重远大于正常对照，被称为“超级小鼠”(Supermice)。4.1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌抗胰蛋白酶。1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得了纯系转基因小鼠。1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。1997年10月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出3只携带有人凝血因子基因转染绵羊。 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。2000年

3、6月22日晚8时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。2001 年英国PPL 公司宣布获得世界首例转基因克隆猪诞生。转基因超级鼠1982年，英国的自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。Supermice1997年2月27日的英国自然杂志报道了一项震惊世界的研究成果：1996年7月5日，英国爱丁堡罗斯林研究所（Roslin）的伊恩维尔穆特（Wilmut）领导的一个科研小组，利用克隆技术培

4、育出一只小母羊。这是世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊。克隆羊多莉的诞生，引发了世界范围内关于动物克隆技术的热烈争论。它被美国科学杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项，也是当年最引人注目的国际新闻之一。 上海医学遗传研究所宣布：取名为“滔滔”的我国首例转基因试管牛于1999年2月19日在上海市奉贤县奉新动物试验场诞生，出生时体重38公斤，经检测它携带有人血清白蛋白基因。这是继去年成功地培育出在乳汁中含有人凝血因子IX的转基因山羊后，该所获得的又一项重大科研成果。 2000年6月，张涌教授培育成功世界首批体细胞克隆山羊“元元”、“阳阳”。图为利用体细胞克隆的山羊“阳

5、阳”（左）和它的克隆体山羊。 2006.12.头口、蹄及舌头呈现出绿色荧光的转基因克隆小猪日前在东北农业大学顺利降生。这是中国培育出的首例绿色荧光的转基因猪，也是世界上第四例通过体细胞核移植技术培育的该类转基因猪。二、转基因动物基本程序(一）待转移的目的基因的获得与设计(二)动物遗传背景及种系的选择在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及种的问题。(三)常用的细胞 1）受精卵：受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎嵌合个体。 (四) 外源基因的导入的方法(五)转基因动物中外源基因的检测和传代(一）

6、待转移的目的基因的获得与设计1、目的基因的来源采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。2、目的基因的克隆通过载体在适当的宿主中克隆选择载体目的基因与载体的连接重组体导入受体细胞通过PCR反应克隆目的基因3、基因构建 现代转基因技术中的“基因”不是仅仅是目的蛋白编码序列(coding sequence)的DNA片断，而是包括基因表达的一整套顺式作用元件(cis-acting elements)。 、启动子（promotor） 启动子位于基因转录起始位点上游不远处，往往含有TATA框以及一些短的调控序列，

7、也有一些启动子不含TATA框而还有Inr序列。启动子序列是构建转基因表达载体时首先要具备的生物元件。组织特异性启动子(tissue-specific)在动物体中，除了那些担负基本生命功能的持家基因(House-keeping gene)以外，绝大多数基因呈组织特异性表达。要使转入的外源基因在特定的组织中表达，就要使用组织特异性启动子。对大多数基因来讲，我们还只能分离它近5端的启动子。及近5端和近3端的增强子，有时还要将一个或几个内含子包括在内，即便如此，往往还是不能达到完全的组织特异性.得到组织特异性表达启动子启动子表达的组织CMV各种组织WAP乳腺-Lactoglobulin乳腺Albumi

8、n enhancer肝脏 myosin heavy chain心脏 、增强子（enhancer） 真核基因的表达除了受位于转录起始位点附近的DNA序列的调控外，还要受到距离很远的一类调控序列的调控。这类序列叫做增强子，其本身不具有启动子的功能，但能够使启动子的转录活性提高数百倍。 、目的基因 目的基因的序列应该包含至少一个开放阅读框（ORF），即含有起始密码子和终止密码子的一段基因序列。以往构件目的基因时一般使用基因文库中的cDNA序列，但实践证明仅仅有cDNA序列往往难以得到有效表达，至少一个内含子与cDNA序列结合会使基因得到更好的表达。 、报告基因（reporter gene）或标记基因

9、常用的报告基因有-半乳糖苷酶(lacZ)、大肠杆菌氯霉素乙酰基转移酶CAT(chloramphenicol acetyltransferase gene)、萤火虫的荧光素酶基因（firefly luciferase gene）、绿色荧光蛋白基因（GFP）和人生长激素基因（hGH）等。这些报告基因都能产生各自特有的化学或发光反应，使对结果的观察变得简单明了。 、多聚腺苷酸化信号 真核生物的mRNA在完成转录后，其3、端要经历进一步修饰，其间相当一段原始转录物被切掉，并在结尾之处装上可多达200个的腺苷酸残基。(二)动物遗传背景及种系的选择 在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及 种系的问题（三）

10、外源基因导入受精卵或胚胎细胞的常用方法显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞法精子载体导入法细胞核移植法生殖细胞转染法（1）、显微注射法1.目的基因的制备与纯化 2.卵供体母鼠和假孕母鼠的准备 3.超排卵与取卵 4.基因显微注射 5.受精卵移植 6.目的基因的表达整合鉴定和检测 7.建系 （2）逆转录病毒法步骤：1.逆转录病毒载体的构建2.选择和培养包装细胞系3.重组病毒DNA导入包装细胞4.收集重组病毒颗粒5.感染胚细胞，使细胞转化 此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法逆转录病毒结构LTR: Long terminate repeat1、逆转录病毒法制备转基因动物目的基因插入区域逆转录病

11、毒法基本步骤构建病毒载体转染包装细胞收集病毒颗粒感染受精卵胚胎移植表达gag, pol, env 细胞逆转录病毒法制备转基因动物的优缺点 优点转基因效率高单位点、单拷贝整合，易分析插入位点鸡卵等含卵黄多的受精卵适宜 缺点随机整合携带外源DNA片段大小受限，一般小于10kb易产生嵌合体（mosaic)，实验周期长有安全隐患，有可能因DNA重组产生活病毒。（3）.胚胎干细胞法这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞， 通过筛选， 把阳性细胞注人受体动物的囊胚腔中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现

12、外源DNA的定点整合。 利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程1.分离培养ES细胞。 2. ES细胞基因操作。 3.获取囊胚期胚胎，以作为ES细胞的移植受体。4.通过显微操作将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。 5.将注射过ES细胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宫内，培育出转基因小鼠。(4）精子载体法意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠。 精子载体法是精子和外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。 外源DNA导入精细胞的方法有DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。（5）细胞核移植

13、法（6）生殖细胞转染法四、外源DNA整合、转录及表达的分子检测1、外源基因的整合检测 2、外源基因的转录检测 3、外源基因的表达检测4.基因动物品系或品种的建立 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传 纯系转基因动物的培育 Founder小鼠正常小鼠 F1阳性小鼠（AO） F1阳性小鼠（AV）正常小鼠近亲繁殖以得到纯合小鼠 F2阳性小鼠（AO） F2（AO）F2（AO） F3（1/4AA，1/2AO，1/4OO） F3（AA）F3（A

14、A）纯合子小鼠交配得到稳定品系 F4（AA）G0代编号检测（3周龄）PCRSouthernG0代整合检测-：弃去+：保留 X 野生型G1代-：弃去+：半合子 X 半合子-：弃去+：纯合子G2代表型检测founder鼠互交五.转入基因的整合和表达外源基因进入细胞后的命运整合到染色体内 随机整合 定点整合游离在细胞浆内暂态表达在核酸酶的作用下降解随机整合（Random insertion） 外源基因随机插入到染色体的任意部位。 插入到致死基因序列内：胚胎死亡 插入到功能基因序列内：基因失活 插入到某调控区作用范围：外源基因表达增强/减弱转基因的整合和表达特征 1-100拷贝左右的外源基因以头尾相连

15、成串的方式整合到小鼠染色体上; 外源基因的整合绝大部分是随机整合; 转入基因整合是稳定的，一部分按孟德尔方式遗传给后代，还有一部分为嵌合体 转基因表达的强弱与整合的拷贝数无关，而与“位置效应”有关;转基因的特异性表达可以只在一种类型细胞中或少数几种不同类型细胞中，也可以在许多类型细胞中表达;转基因构件中原核生物的序列可能会抑制某些基因表达;没有内含子的cDNA基因的表达比基因组DNA基因表达要弱得多;少数转基因位点的两侧序列有重排现象。提高转基因表达的策略1.导入大片段（LCR序列）2.共整合和基因搭救 这可能是一种很有用的策略，即将表达水平较高的基因与另外一些表达水平低的基因一同整合进宿主细

16、胞的基因组中(同一位点串联整合)，这样的处理对增强表达水平低的基因构件的表达具有明显的作用。3.增添基质附着区 核基质附着区(MAR)可能是结构基因的界域，它将染色质分成许多可独立调控的单元。构件太大MARLCR转基因构件不受位置效应的表达六、动物转基因技术的研究意义1、研究基因的结构和功能及其表达与调控2、建立人类疾病动物模型3、研究人类疾病基因治疗 4、研制生物反应器，生产天然活性药物蛋白 6、改良动物品种 肿瘤转基因小鼠的模型 SV40 T小鼠肿瘤模型的建立猿猴病毒SV40作为一种致瘤DNA肿瘤病毒被广泛证实可引起物多种肿瘤形成 ，其致瘤作用主要通过其早期区域基因编码产物大T抗原实现。S

17、V40 T 影响细胞周期调控蛋白P53的功能；SV40 T 与肿瘤抑制蛋白RB，使其丧失功能 。此外还与多种转录因子和细胞周期调控蛋白作用，致使细胞分裂加速，形成肿瘤，是致癌机理研究的较为透彻的一种蛋白。脑癌胰腺癌1987年，美国NIH的科学家首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白质tPA,展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。转基因生物反应器 定义：将目的基因导入动物体内形成转基因生物，由于基因表达，可以从转基因动物的特定组织或器官（乳汁、血液等）获得目的基因产物。使转基因动物象一个活的发酵罐一样来生产目的基因的产物。 步骤（图）：采用上述方法获得的转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病的药物

18、tPA（组织溶解酶原激活剂）。十大神奇转基因动物 这些五彩斑斓的脑细胞是单个的神经元，鲜艳的色彩帮助科学家将它们区分开来。哈佛大学的杰夫-里奇曼为首的科研小组在实验鼠的基因组中导入水母的绿色荧光蛋白基因，使其在紫色光线的照射下呈现出绿色荧光。这种绿色荧光基因对小鼠无害，只起到标记作用。 荧光鼠七.转基因动物存在的问题发展趋势 1.转基因动物的成功率和成活率极低2. 难以控制转基因在宿主基因组中的行为3.大部分转基因表达水平极低，而极少部分转基因表达水平过高4.阳性转基因动物筛选不易八.转基因动物的安全性问题外源基因的插入可能对宿主动物自身有影响,造成基因污染对生态平衡以及物种的多样性造成不良影

19、响 ;转基因移植可能加大“人畜共患病”的传播机会,给人类带来灾难性的损坏; 转基因动物制品的安全性也是值得谨慎的一个环节,因为它有可能导致过敏等反应;转基因动物的研究将导致一场社会伦理的大讨论。 小 结转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的手段 . 二.基因敲除动物 (gene knock out animals) 什么是基因敲除技术？1987-89年 Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几个

20、研究小组首次对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。到目前为止，已经培育出上千种基因敲除小鼠。三种技术的融合二、基因敲除的基本程序1 、构建打靶载体 1）同源序列 2） 打靶载体常含两种筛选标志 neor ：新霉素抗性基因，阳性筛选标志， neor基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。neorHSV-tkHSV-tk(更昔洛韦)：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志， 该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。 HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，Tk-基因往往丢失；随机整合时， Tk-基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时获得neo和HSV-tk两个基因的打靶细胞。启动子HSV-TK同源序列同源序列Neo2、 将载体导入ES细胞 选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES) 。 把外来基因转入胚胎干细胞。 并筛选打靶成功的细胞。随机整合同源重组3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。5 、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。常有的方法有：Southern印记、N