PI3KAkt信号通路在阿尔茨海默病、帕金森病患者外周血淋巴细胞中的表达及意义

1、PI3KAkt信号通路在阿尔茨海默病、帕金森病患者外周血淋巴细胞中的表达及意义 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。本学 位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医 科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要 内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、 申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 研究生签名帮号师签章孑黜二级学 i撵霆华； 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 ? 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢

2、等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 。j 研究生签名： 彻 导师签章：；苏司绎j霉蒺鞠 计；月V扫日 目 录 煳瓣 中文摘要l 英文摘要3 研究论文P13眦信号通路在阿尔茨海默病、帕金森病患者外周血淋 巴细胞中的表达及意义 前言?一“一“一“一一“一“6翮舌一“一一“一“一“6 材料与方法6 O 结果?-?-?“?1 附图?1l 附表?14 讨论?-?15 结论?21 l 参考文献2 综述 致谢?-?-?-?40 个人简历41 中文摘要 P13l淞kt信号通路在阿尔茨海默、帕金森病患者外周血淋巴 细胞中的表达及意义 摘

3、 要 dise嬲e，AD 和帕金森病 目的：阿尔茨海默病 Al吐eimers P矾dnsons 的发病率随着年龄的增长而增加。AD是老年人痴呆最常见的原因，及时 在早期诊断并加以干预是痴呆临床工作的重点，但至今尚无用于诊断AD 的可靠外周标记物。大量研究证据显示，神经细胞重新进入细胞分裂周期 导致细胞周期紊乱是AD的病理学根底。神经元的死亡和丧失是AD最主 要的病理特征，细胞周期重启的失调为研究AD神经元的死亡提供了新视 角。在正常大脑中神经元处于一种有丝分裂后的分化终末态，在神经变性 的病理情况下，神经元可进行分裂增殖，重新进入细胞周期，但这些被迫 重新进入细胞周期后的神经元并不能继续分化，

4、而是走向死亡。细胞周期 重启的失调发生在AD病程的各个阶段中，可能是迄今所能检测到的AD 病程中的最早期事件。研究发现凋亡和细胞周期失调发生于AD早期，不 仅局限于神经元，而且表达在人外周细胞，如外周血淋巴细胞。P13列舭 信号通路在细胞周期调控及凋亡过程中起着极其重要的作用。据此，本次 研究拟通过测定AD患者外周血淋巴细胞中心的蛋白表达和活化，以帕 金森病 P破insons 为进一步研究方便有效的AD外周标记物和潜在的治疗靶点提供实验依 据。 方法：入组病例40例，均来自河北医科大学第二医院神经内科门诊 患者 男性7例，女性13例 ，采用美国国立神经病、语言机能紊乱和 national 卒中

5、研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会 me instituteof s仃okeaIldleAlzheimer andcommunicatiVedisorderS锄d s neurological diseasea11drelateddisorders 准，纳入AD患者并无家族史； 中文摘要 例 ，无认知障碍且符合2006年中华医学会公布的PD诊断标准。同期 健康对照组来自健康体检老年人，共20例 男性8例，女性12例 ，年 龄和性别构成比与病例组相比无明显差异，经神经心理学检查认知功能正 常。抽取新鲜静脉抗凝血，采用淋巴细胞别离液依据密度梯度离心法提取 淋巴细胞，利用蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制

6、剂和总蛋白提取试剂盒提 取蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，取等量蛋白应用蛋白质免疫印迹 westem blo位洒g 技术检测淋巴细胞中总怂及其活化形式即磷酸化Ah p地 的表达，分析比拟三组中心表达水平及活性的差异，并利用 Pearson r 相关分析探讨心表达与AD、PD病程和病情的关系。 结果：与正常对照组相比，总的心、p舭蛋白表达水平在AD患 者的外周血淋巴细胞中均明显升高，具有统计学意义 p O05 ，且总 心的表达量与AD患者的病程和认知障碍严重程度呈正相关 r 0602， 高 p O05 ，且其表达水平与PD的临床表现没有相关性。 结论：细胞周期失调与凋亡是神经变性疾病最主要的两种病

7、理机制。 P13龇信号通路在调控细胞周期和细胞凋亡中有着重要的作用，在神 经变性病中被广为研究，然而其在外周血淋巴细胞中的研究很少，而不加 以干预、直接检测神经变性疾病患者外周血淋巴细胞中的生物标志物在国 内未见报道。本次实验结果说明AD患者淋巴细胞中魅的表达水平及磷 酸化水平均显著升高，并且舭在淋巴细胞的表达水平与AD患者的病程 及病情密切相关，因此这些发现证明AD的病理表现不仅局限于中枢神经 系统的神经元，而且可以在外周血淋巴细胞中检测到，说明AD是一种系 统性疾病。并且本实验结果也提示触在淋巴细胞中的检测有可能为AD 的诊断和病情监测提供方便而有效的外周标记物，为AD的治疗提供可干 预的

8、靶点。 关键词：舭；阿尔茨海默病；帕金森病；淋巴细胞；蛋白免疫印迹 荚文摘要 andann Ol量，13量“AktofP13l淞kt inin EXDreSSlonS12nllICanCe SlgnaIjIn2DathWaV Expressionsignificance signaIingpathway of diseaseand AIzheimers Par瞄nsOns pelipherallymphocytes l J dlSeaSe DatlentS ParkiIlsons objectiVe：Al吐eimersdisease AD and diseasesandtlle mosedis

9、eaSesare neural incidencesof increase degenerative wittl ismemostcommonreasonof age伊owingAD focal cliIlical、 I，orkishowto i11tlle ofADand stage poi】吐of diagnoseearly inits t0 t11ereisnot inter&re now pmgressHoweVerup sa佗typeripheral biomarker旬r eVidences matneurons study suggested diagnosis【ultipIe

10、cell and cell disorderbet11e reenteringcycleleadingcyCle may patllobi0109 ， and tl媳main baSisofADNeuronsdeathlostare charaCteristicsof pa：tllologic ADaIldcell disorder anew meneuronsdea：tll Cycle mayproVidewayto咖dy inADNeul0l：lSare协ledifIferentiationendofmitosisi11no册albrainmen wouldbediVisionand ar

11、ld rleulodegeneratiVeh印pened，neulons proliferation cen reemermeceU meneurons、h0areforced证to CycleNeVer吐leless cycle dontdifferentiatebuttodeathThedisorderofcell c觚be go restarting cycle seenin ofAD it bemeearliesteVentofAD may eVe巧stageprogression觚d nlatcell disorderand arein plrocessResearchessugge

12、st cycle apoptosisearly iIl ofADa11darenotlimitedneuronsbutalsoiIlhInaIl cells stage peripheral blood aul pamwayplay such舔peripherallynlphocytesP13KAlCtsigIlaling roleillceU and meground，mis inlpor咖t cycleregulationapoptosisOn to AI tarlditsactiVatedstatusleVelsof e 【periment仃yi11Vestigate expressio

13、n in ADa11dcon缸astedwimPD and periphemllymphocytes PBLs ofpatients ex锄inationeldersto correlationsP13K幽Jkt healtll nle of eXplore sigllaling forconVenient andADand evidences and p劬啪y PD，pr0Vidingexperiment biomaIkersand ofAD targets safet ，peripheml potentialtherapy Methods：40wereinvolVed舶mmeSecond

14、ofHebei patients Hospital Medical t11e of20211020211 UfniVersi锣d嘶ngp耐od 3 英文摘要 and me of mildmoderate 3 probable AD 7males，1females ，印plied patients clillical criteriaoftllenationalinStituteof and diagnosis neurological disordersandstrokeandmeAlzheimersdiseasea11drelated cor姗unicative disoders雒socia

15、tion involVed werenot QnNCDSADRDA andpatients AD PD 2 haVe males，1females ，didnt familypatients 2 20patients 8 of coincidenCewimPD Chinese disorders觚d c0911itive diagIlosis耐teria Medical in200620 con仃olsofme healmy Association CMA anno吼ced examinationeldersaIldt11erew弱no time werehealm corresponding

16、period di行erencesinconstnentratioof and aIld aginggender werenomal testAU unde刑entVenousb100d subjects byneuropsychological wereisolated lymphocytes byFicoll-Hypaquedensity sampliIlgPeripheral totaJ by prImiIl 倒ientcen仃ifIlgationAbstractedprotein inhibitora11d inhibitorA缸rdetected adding proteinphos

17、phataSe protease BCA conCentration method，pd戏and A虹 pA蛐 protein by phospholated detectedwestem alldme leVelsof were by blotting expression证lymphoces oftotal狮daCtiVatedA虹leVelswere iIltIuee changes a11alyzed groupsThe collrelationsof leVelsanddiseasesdurationsandseVeritiesof A虹expression co玎elation A

18、DaIldPDweredeteCtedPeaursons by a11alysis were ResuIts：BomtotalAktaIldaCtivatedstatuslevels Akt AD wim total levels PBLsof patie鹏i11comparedco“呐ls p 005 and and 、ere correlatedwithmediseaseduration positively cogmtiVeseVeri够 were pA虹leVels increasedin ofPD wim si鲥ficantly lymphocytescomp2ured Aktlev

19、elsandclinicalsitI】ationofPD andmerewasnocorrelationbet、veen Conclusions：Cen disorders are研o main cycle and印op协sis of dise弱esP13KAkt pathomechanismneurodegeneratiVe signaliIlgpamway an rolein cell is controllingcycleaIld印0ptosis，andwidely playsimportant in isfewresearChes diseaSesHo、velver，mere inVe

20、stigatedneu暇degeneratiVe ofP13KAl t in haSnot sigIlalingpacllwayperipherallymphocytes锄drepons showthatbiomarkersare detectedwiulouti11teentionsiIl directly diseaSes researchresult Akand yetOur suggests也at讹l neWodegeneratiVe 4 英文摘要 leVelsare incre2usedillAD and p-AI texpression significalltly lynlpho

21、ces Al t levelsmAD co仃elatew池durationanddisease lymphocytes severityAn t王1eresultsdemons乜atethattlle mallifestationsofADarenot patholo西cal only limitedinneuI-0nsofcentralneural b眦alsocanbe i11 system deteCted thatADisa diseaseOurresults peripherallymphocytesiIldicating system also AI t a be biom锄ker

22、of suggestsmaypotentialperipheral earlydia印osis and conditionestiIIlationsAD and patients d谢ng processesproVidepotential interventionf0r ofAD targetthe豫py Keywords：Akt；Al办eimersdisease；Par姑nsons westem blotting 研究论文 P13KAkt信号通路在阿尔茨海默病、帕金森病患者淋巴细胞中 的表达及意义 -!苎 刖 罱 阿尔茨海默病 Al吐eimers 年龄的增长而增加。而随着人口平均年龄的延长

23、，这两种疾病产生的健康 和经济负担也随之不断增加。 世界上超过35亿人患有AD，一种以记忆障碍伴随言语不能、失用、 失认等为特征的认知领域退变的疾病，在发病3到9年内死亡。AD是痴 呆最常见的一种，占尸检和临床病例的5056。AD合并脑血管疾病的 占1317。AD已被公认为是一种严重的社会健康问题和沉重的经济负 担。 如何在早期及时诊断AD一直是痴呆临床工作的重点，但至今尚无用 于诊断的外周标记物。研究发现凋亡和细胞周期失调发生于AD早期，不 仅局限于神经元，而且表达在人外周细胞。P13科舭信号通路在细胞周 期调控及凋亡过程中起着极其重要的作用。据此，本次研究拟通过测定 AD患者外周血淋巴细胞

24、中舭的蛋白表达和活化，以帕金森病 Paddnsons disease，PD 患者和同期健康体检者为比照进行统计分析， 研究方便有效的AD外周标记物和潜在的治疗靶点提供实验依据。 对象与方法 l研究对象 入组病例40例，均来自河北医科大学第二医院神经内科门诊20lO 研究论文 dementia 分 Clinical national 能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会 the 2uld instituteof communicativedisorderss仃olandthe neurolo西cal锄d a11drelat|甜disorders Alzheimersdisease 临床

25、诊断标准，纳入AD患者并无家族史 TabIe aIldYahr分级，平 病程l4年，平均病程 258206 年；依据Hoehn ParkiIlsons disease 均 235士064 ，采用帕金森病统一评分量表 u11i矗ed rating 障碍 Table2 。同期健康对照组来自健康体检老年人，共20例 男性8 组相比无明显差异，经神经心理学检查认知功能正常。 所有入选对象均排除患有严重心、肝、肾及其它全身性系统性疾病、 脑卒中病史、精神系统疾病、手术史、外伤史和其它重大疾病史。家族中 均无痴呆患者。 所有入选患者及健康人均由其本人或监护者签署知情同意书。 2方法 21 样品处理 4小时

26、之内，新鲜抗凝血与Hanks液l：l混匀后，加于同体积的淋巴细胞 别离液上，以1500转别离心15分钟，收集淋巴细胞层，磷酸盐缓冲液 Buffered Salme，PBS 洗涤三次获得淋巴细胞。 Phosphate 22提取总蛋白 结合缓冲液参加淋巴细胞，震荡重悬，4静置2分钟； 2 按裂解液：抽提试剂比例为l：2参加抽提试剂，震荡混匀。4静 置10分钟； 3 4离心10分钟，溶液由蛋白膜分为两相。吸除上层及大 10，0009 局部下层溶液，保存蛋白絮状物； 4 参加无水乙醇洗涤蛋白絮状物。10，ooO酣离心3分钟； 5 尽可能除去管中液体，敞开管口，室温自然枯燥沉淀： 研究论文 浴箱中煮5一

27、lO分钟至完全溶解，有时溶解很长时间还有不溶物但颜色与 质地较前不同此时可终止水浴。 23蛋白浓度的测定 231 所需材料和仪器：96孔板，BCA bic洫ChoninicaCid，二辛乘可酸 ProteiIl mfinite 蛋白浓度测定试剂盒 BCA Assay飚t ，酶标仪 Tecan M200PRo o 232 BCA法测蛋白浓度 1 将96孔板依次用清水、蒸馏水冲洗干净，烘干，75乙醇浸泡。 使用前用清水、蒸馏水冲洗，烤箱烘干； 2 酶标仪读空板，设置标准蛋白孔、空白孔、样品孔； 3 分别为lOOOugml、500um1、250u咖l、l 的标准蛋白； 4 配置BCA工作液：每孔的量

28、按照200山BCA+4l硫酸铜计算； 样品蛋白 ，空白孔参加25ul生理盐水； 6 读板30分钟，测出样品浓度值。 24蛋白质印迹法 、estem blotting 241配胶和灌胶 1 洗净配胶用玻璃板，蒸馏水冲洗，置于烤箱烘干，将玻璃板固定于 配胶架上； 玻璃板间隙内，待灌至23高度后以异丙醇封闭，配胶过程中注意防止气 泡形成； 3 待别离胶凝后，吸净浓缩胶上方的异丙醇，配制浓缩胶参加玻璃板 间的空隙，迅速插入梳子，注意防止气泡形成； 4 2小时后拔出梳子，拔出过程中注意防止梳孔变形。 242蛋白热变性 研究论文 bu毹r，混匀后loo水 各组取等量蛋白 80鸺 ，分别参加loading

29、浴热变性。 243 电泳 1 将配好的胶板安放于电泳槽内，参加电泳工作液，排净上样孔中的 气泡； 2 在各孔中参加蛋白样品，选择适当的孔位参加M矾 er； 带位置决定结束电泳时间。 244转膜 nuoride， 1 配制转膜工作液，并裁剪好聚偏二氟乙烯 Polyvinylidene PVDF 膜及滤纸；甲醇浸泡P F膜3分钟后，将膜转移到转膜液中， 并将滤纸也浸泡入转膜液，备用； 一P F膜一滤纸的顺序铺好，注意排净气泡； 3 将铺好的胶和PVDF膜按胶负膜正固定于转膜槽内，在4下以 300rI迭恒流转膜。 245封闭和杂交 1 封闭：将转好的膜用TBST漂洗，浸于5脱脂牛奶中，摇床缓慢摇 荡

30、封闭1小时； 漂洗：I抗孵育结束后，用TBST漂洗3次，每次10分钟； 的II抗中室温摇床缓慢摇荡1小时； 4 漂洗：II抗孵育结束后，TBST漂洗3次，每次lO分钟。 25采用odysseySystem扫描P F膜，对图像进行定量分析。 26主要试剂 Signaling公司， 兔抗人p。舭 Ser473 和鼠抗人珧1均来自美国Cell GAPDH抗体来自上海康成生物，山羊抗鼠和抗兔IgG来自美国 Rockland公司。淋巴细胞别离液购自天津市灏洋生物制品科技。 研究论文 蛋白磷酸酶抑制剂混合物、总蛋白提取试剂盒购自普利莱基因技术有限公 司。蛋白酶抑制剂、蛋白BCA定量试剂盒购自siglIla

31、公司。 27统计分析 数据采用sPSSl7O统计软件包进行处理。各组数据检验正态分布后， 以均数标准差 xs 表示，多组织间的比拟采用方差分析。各变量之 间的关系采用Pearson r 相关分析。p O05认为有统计学差异。 皇日结 木果 21 AD组与正常对照组怂、p一舭蛋白水平的比拟与正常对照组相 比，总的怂及p魅在AD患者的淋巴细胞中蛋白表达水平明显升高 p O05 。 Fig1 22地与AD病程及病情的关系经Pearson相关分析得出，触蛋白 MMSE评分呈负相关 F-O560，p o024 。 F碡3 23 PD组与正常对照组地、p一舭蛋白水平的比拟与正常对照组相 比，在PD患者的淋

32、巴细胞中，触蛋白表达水平轻度升高，但无统计学 意义 p O05 ；p心蛋白表达水平显著增高 p 005 。 F毽1 研究论文 _一 附 图 A Con 曩-+一Akt 捌_曩嘲黑曩一卜p怂 黉-卜GAPDH B 4O一 30? 2O- 。T一 舌望_芑l 1O- 0o- 口 对照堂I AD组 PD蠡L C 050- 040- 0妒 芑置i苫笛-聿l O廿 010一 000一 AD PD 研究论文 Fig1：A虹expression访patientsperipheral t11e Ah inununoblot expression and depicting ofl，phospho秽latedg

33、印d11 in of of peripheral lynlphocytesCon，AD，PD B Graphicalreprese删ion total meratiobetweentlleamoum of A虹expressionResults x士s represent total aIld of proteing印dh加mlysis of O05，ADVsCon C Gr印hicalrepresentation t11e of t0tot甜 e |【p舱ssionResults x士s represemperCentage phospho巧lated and PDVsConCon： pro

34、teillAN0、后：F 6699，p 0008，p O05，AD disease disease controls；AD：A1zheimerspati黜她；PD：ParkiIlsonspatiems 严O眉眈p-oDl4 4沪 3沪 2铲 王o量譬-lg 1俨 O俨 oIo 1Io 2Io 3Io 4。o 绱程f年 Ah be铆een anddiseasedurationinaHAD Fig2：Conelationsexpression patients 严山目的呻勉 3铲 2铲 Zo暑2p善一I善 1 争 0沪 订o ，!o 1J；o 130 190 晶o MM钯 12 研究论文 andd

35、isease score seVerity N伍MSE belen舭expression Fig3：Conelation inallAD patie椭 13 研究论文 附 表 Tablelclinicaland dataofAD demogr印hic patient眍!主堂 AD患者临床及人口统计学资料 xs NO 男女 20 713 年龄 岁 6675士779 病程 年 23士177 MMSE评分 l543士448 CDR评分 12土O3 mentalstate 削阿尔兹海默病；MMSE 简易智能精神状态量表，mini dementia examination；CDR手临床痴呆量表，clin

36、ical rating。 and PD Table2clinical demographicofpatients【t土砬 diseasescale。 P砌血sons L RDS 帕金森病统一评分量表，unified rating 14 研究论文 讨 论 阿尔茨海默病和帕金森病是常见的神经系统变性疾病。大脑相关区域 神经元退行性变、丧失是神经系统变性疾病最主要的病理特征，其机制尚 未说明。越来越多的证据显示凋亡、细胞周期失调与神经元丧失有密切关 31 in弱e A虹信号通路中丝氨酸苏 酰肌醇3激酶，phosphatidylinositol 血淋巴细胞中的变化。 AD是老年期痴呆最常见的类型，是由

37、德国医师AloisAlt吐eimer在 1906年最先描述，并以其名字命名的。是一种以记忆及其他认知领域受 到损害为特征的慢性进行性疾病。AD的神经病理损害包括老年斑形成、 神经纤维缠结和神经元的缺失【l】oPD又称震颤麻痹 p砌ysisagitans ， 由英国医生Janles 运动障碍疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体 Le、Wbody 形成为病理特征，临床上表现为静止性震颤、运动缓慢、肌强直以及姿势 步态异常。 AD的患病率约为5左右，且女性高于男性。AD发病的危险因素有 以下几点： 1 本人的生物学特征； 2 本人的既往史以及合并症； 3 家族史； 4 嗜好及其饮食习惯； 5

38、 接触的物质和环境； 6 社会 以及心理的要素。其最主要的危险因素是年龄，患病率随年龄增加而有增 高的趋势。在每10万人中，超过65岁的新诊断AD的患者有1275例， 每五年AD的发病率增加一倍。一项有关百岁老人的数据显示，AD不是 衰老的必然结果，然而，在85岁以上的人群中，每三个人中就有一位诊 断为AD。随着老龄化人口的增长，AD的患病率也在不断增加。我国60 岁以上老年人口有12亿，痴呆患病率为38，其中60以上为阿尔 茨海默病，以此比例，在我国估计有400500万AD患者，而且随着老 年人口的快速增长，仍在继续增长之中，成为继肿瘤，心、脑血管病之后 导致死亡的第四位疾病，给政府、社会和

39、家庭带来沉重的经济和生活负担。 由于本病具有起病隐袭、病程漫长、病情开展呈现渐进性，诊断过程 复杂，缺乏有效治疗方法等特点，提前筛查并及时诊断、及时进行干预治 研究论文 疗是防止本病进一步开展的关键。尽管人们一直试图阐述AD的发病机 制，但一个世纪过去了，该病的发病机制仍未明确，因此对其还无有效的 诊断、治疗及预防手段。 在AD中已经发现了许多分子损害机制，早期诊断AD，发现MCI 患者是制定治疗策略的根底，因而获得疾病早期简便、有效的外周标志物 将对AD诊断及治疗有重要意义，但至今尚无这样的标记物为临床所应用 【21 O AD的发病机制比拟复杂，除了的Ap以外，许多其他的致病机 制也参与其中

40、。越来越多的证据显示凋亡、细胞周期失调与神经元丧失有 密切关系。一些研究发现，细胞周期的状态很大程度上影响着神经元的易 损性和神经变性的途径【6母l。对细胞周期的控制能力已经被认为是阻止神 经元进入到有着高风险的向着神经变性方向开展的易损状态的关键因素 【101。大量研究证据显示，神经细胞重新进入细胞分裂周期导致细胞周期紊 乱是AD的病理学根底【3】。神经元的死亡和丧失是AD最主要的病理特征， 细胞周期重启的失调为研究AD中神经元死亡提供了新视角。细胞周期重 启的失调发生在AD病程的各个阶段中【4】，可能是迄今所能检测到的AD 病程中的最早期事件【51。Yang等人【30】已经在轻度认知障碍

41、mildcognitive 在MCI患者的淋巴细胞中存在细胞周期紊乱。这些发现说明细胞周期诱 导的死亡是AD主要的机制特点，因此细胞周期凋亡调控紊乱蛋白或许 能够作为AD的标记物。 依据细胞周期假说，G1S调控点失调和细胞周期重启是AD患者神 经变性和神经元死亡的主要原因。众所周知，在正常大脑中神经元处于一 种有丝分裂后的分化终末态即细胞周期的GO期，在神经变性的病理情况 下，如果神经元重新进入细胞周期进行分裂，神经元并不能继续分化，而 是导致神经元的功能出现障碍，产生一系列病态的产物，导致细胞死亡【l。 越是控制人类高级功能的神经元越容易出现细胞周期失调，进行错误的细 胞分裂，最终走向死亡【

42、12】。 一些研究显示，AD通过细胞凋亡发生细胞死亡，暗示了这种严格控 制的细胞死亡形式对AD的大脑神经元细胞死亡是负有责任的 至少在部 分上是 。扰乱细胞凋亡的控制机制能导致激活或抑制细胞死亡的进程。 研究论文 细胞凋亡不恰当的激活可以引起某些疾病，例如获得性免疫缺陷综合症 AIDS ，缺血性损伤和神经变性疾病。 细胞周期假说描述的AD开展有两个阶段：第一步，早期形态失调控 即突触更新失控，神经元从GO期进入到G1期，开始细胞分裂；G1S调 控点失调，神经元从Gl期通过DNA复制的S期进入G2期那么是第二步。 G1S调控点失调是AD发生所必须的，也由此可知AD是一种细胞分裂 障碍所产生的现象

43、。研究已经证实，肿瘤同样也是细胞周期失调，从而导 致细胞异常分裂所产生的，因此，在某些肿瘤如神经胶质瘤中可以出现 AD病理改变中的神经元纤维缠结样改变。 尽管AD被认为是神经系统的疾病，但是，有研究提出，AD主要的 临床表现不仅源于中枢神经系统，还在脑组织以外的组织中的细胞和分子 水平有系统的表达【13。16】。尽管这些改变在中枢神经系统之外还没有临床上 的结论，但是，这些变化说明AD是一种系统性疾病，这些细胞和分子水 平的改变在外周细胞和脑组织中的表达水平是相平行的，这个结果为局部 解释临床表现提供了一种可行的病理生理模型。这项工作特殊的相关性就 是事实上AD患者细胞周期紊乱不仅仅存在于神经

44、元，而是一种更广泛的 影响细胞的现象【17捌】。因此，某些外周组织如皮肤的成纤维细胞和淋巴细 l懿 胞成为了研究各种精神神经疾病的系统性表现的模型【221。此外De Cuevas N等人【23】的研究证据显示AD中细胞周期的失调不仅局限于神经 元，而且表达在外周血的细胞，如淋巴细胞中。淋巴细胞为研究细胞周期 相关事件在AD发病机制中的作用和寻找可干预的靶点提供了方便可行 的模型。深入研究淋巴细胞中细胞周期重启的失调可能为早期诊断AD提 供方便有效的外周标记物和药物干预的靶点【24】。 最新的研究说明，在AD中，凋亡和细胞周期失调不仅局限于中枢神 经元，而且存在于外周细胞【251。激酶系统激活是

45、细胞周期最显著的特征之 一。在AD患者的脑组织中，有许多细胞内信号发生了改变，包括P13眦 信号通路。然而有关这些改变的信号通路所产生的病理变化还有待了解。 P13刈魅信号途径是细胞周期调控及细胞凋亡过程的关键通路之一。 P13黜细胞生存信号通路在细胞膜上由生长因子【3l32】或是细胞之间的 粘附【33琊】激活。P13K细胞生存通路的效应是由其下游的蛋白激酶BAh 来实现的。已经在多种神经系统变性疾病中发现了触的表达发生改变， 研究论文 如Picks病、进行性核上性麻痹、皮质延髓变性和亨廷顿病等。于此同时 亦有研究显示地基因多态性与PD的发病风险密切相关【261。这种改变也 可能在AD和PD的

46、发病机制中有重要作用。据此，本研究检测了正常对 照者、AD和PD患者外周血淋巴细胞中心与p心的蛋白水平。本研 究结果显示，相较于正常对照组，AD患者淋巴细胞中心及其活化形式 信号通路上调，心蛋白水平在AD患者的外周血淋巴细胞中高表达，且 其活性也上调。 本研究结果显示，魅与p脂在AD患者外周血淋巴细胞中蛋白水 平均显著升高同时，提示P13眦信号通路在AD中是上调的。本结果 与黜cl【le等【2729】在尸检中观察到AD大脑颞叶皮质地活性增高， 仅发生在中枢神经元，而且存在于外周血淋巴细胞，可能为AD患者所特 有的系统性表现之一，极有可能成为用于AD诊断的外周标记物。其次， 本次实验结果提示AD

47、患者淋巴细胞与神经元在凋亡和细胞周期调控机 制上可能存在相同的缺陷，这为研究其机制和潜在的治疗靶点提供了一种 可行、方便的外周细胞模型。 P13眦信号通路是体内一条重要的调控通路，其参与了许多细胞 的增殖和分化过程。在大多数细胞中，细胞生存和增殖的过程都依赖于 P13KAkt信号通路，通过营养的配体受体之间的相互作用激活下游的信 号级联介质【3矾。对P13眦信号通路的研究是通过应用其药物抑制剂 巴母细胞的增殖能力和生存能力都较正常对照组升高【40431。AD细胞系升 高的增殖活性与他的高磷酸化水平和细胞周期G1S调控点抑制剂p2l、 p27的下调有关。 诱发细胞周期重启，导致细胞凋亡。Hsue

48、ChChengCmang等人【45】发现抑 丧失可通过遗传沉默或药物抑制P13K功能而得到挽救。Ma等人】的体 研究论文 外实验显示，培养PCI2细胞时参加Ap可降低舭的活性，相应的，升 高的心活性减少了细胞培养时Ap42诱导的细胞死亡。而另一研究显示， 小鼠的初级神经元急性暴露于AB42，会上调她的磷酸化水平【471。上述 研究说明，体外实验的结果与一贯的概念相符细胞生存信号通路 P13KAkt上调在AD的发病过程中具有保护作用。 P13鼬信号途径是从受体酪氨酸激酶被生长因子或胰岛素刺激， 从而磷酸化激活两个舭激酶。舭通过磷酸化抑制一些凋亡前靶点， 或是激活重要的自噬、血管生成和蛋白合成过程

49、中的调节器mTOR复合 2a，PP2a 物，促进细胞增殖和存活。蛋白磷酸化酶2a proteinphosphatase 家族能够去磷酸化抑制舭，也直接去磷酸化Bcl2促进凋亡。肿瘤抑制 子，是在1977年St砚l及其同事在别离鼠白血病病毒转化形式时发现的， 等人通过病毒编码致癌基因，克隆出v舭f49】。地，也叫蛋白激酶B I inase protem 蛋白激酶 I孙531，是丝苏氨酸激酶家族中的一员，有三种亚型，Aktl，2 和3。舭的三种亚型的结构很相似，都含有PH域，ATP结合位点，和 两个磷酸化位点。一般位于细胞胞浆中。舭由480个氨基酸残基构成， 包含一个与血小板白细胞C激酶底物 普列

50、克底物蛋白 同源区 其激活【52。54】。围绕着他的中心区域，有一大片激酶区域，腹侧是疏水的 羧基末端和富含脯氨酸的区域【541。舭通过磷酸化两个残基m308和 显示P13眦信号通路在AD及PD外周血淋巴细胞中的改变。 l in舔e， 酸盐 phosphatidylinositol 磷酸盐 phoSphatidylinositol 研究论文 由P13K细胞内脂类激酶的一种IAPl3K介导的，可被生长因子酪氨 酸激酶受体 receptor呻sme factor 岛素样生长因子受体 i11sulin1ike gro、m factor 板源性生长因子受体 plateletderivedgrowm 表

51、皮生长因子 印idemlal舯w吐l 蛋白偶联受体和癌基因胁等。P13K的其他类型不能激活地。在细胞 lO催化亚基可以特异性作用于PIP2，生成PIP3。 膜上，P13K被激活后，p1 S6 S6激酶 曲osomal 他丝苏氨酸激酶包括PKC、核糖体p90 p90bn嬲e， 入到胞浆中或是胞核内，通过磷酸化一系列底物，激活或者抑制下游的靶 已经证实触能通过多种机制在不同水平影响细胞凋亡途径从而抑制凋 亡，从上游的调节转录活性的信号途径到下游的靶点底物如caspase一9。 其中，舭可通过ciun和f-o舳ead转录因子家族抑制凋亡前转录活性。 和F脉RI，1 和调节线粒体电位来发挥其抗凋亡作用

52、【651。同时，活化后 的地可下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 如p2l、p27 ，导致细 胞周期关键事件的改变，与凋亡的调控和神经元变性密切相关。另外， 心可激活eIF4E，调节线粒体细胞色素C的释放来抑制细胞凋亡。地 活化后磷酸化其下游的转录因子如FOXO家族蛋白，使其灭活，从而使 两者与1433蛋白相结合。此外，P13列舭信号途径可激活雷帕霉素靶 蛋白 mammalian target glycogens皿has 及到神经元死亡、tau磷酸化和AB多肽的生成【6869】。 此外，我们的结果说明AD患者淋巴细胞中舭的蛋白水平与病程和 认知障碍严重程度呈正相关。患病时间越长，MMSE评分越低

53、，淋巴细 胞中舭的表达水平也就越高。另有实验显示地在记忆形成过程中发挥 20 研究论文 了重要作用【70】，本研究结果亦提示触信号通路与AD的发生开展密切相 关，有可能成为反映AD病程和评价病情的一个重要指标。 在本次实验中，我们发现PD患者淋巴细胞中磷酸化的脂水平较正 达舭的结果相一致，然而本实验未发现淋巴细胞中舭的表达水平与 PD病程的相关性，因此本结果提示在PD中，凋亡及其调控通路的改变 可能不仅局限于中枢神经元，而是全身系统性表现之一。 结 论 细胞周期失调与凋亡是神经变性疾病最主要的两种病理机制， P13眦信号通路在神经变性病中被广为研究，然而其在外周血淋巴细 胞中的研究很少，而不加

54、以干预、直接检测神经变性疾病患者外周血淋巴 细胞中的生物标志物在国内未见报道。本次实验结果说明AD患者淋巴细 胞中心的表达水平及磷酸化水平均显著升高，并且触在淋巴细胞的表 达水平与AD患者的病程及病情密切相关，因此这些发现提示心在淋巴 细胞中的检测有可能为AD的诊断和病情监测提供方便而有效的外周标 记物，为AD的治疗提供可干预的靶点。 参考文献 1 inAlzlleimer Brain 1br巧DNe啪pa山ologicalchanges diseaseProg Res，1994，101：383390 2 TBloodProteill the Britsc岵iMWyssCoray Si印atu

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