第四章分子生物学研究技术

1、第四章第四章 分子生物学操作技术分子生物学操作技术v4.1 4.1 凝胶电泳技术凝胶电泳技术v4.2 4.2 核酸的提取和纯化核酸的提取和纯化v4.3 DNA4.3 DNA测序技术测序技术v4.4 PCR4.4 PCR技术技术v4.5 4.5 核酸分子杂交核酸分子杂交v4.6 4.6 重组重组DNADNA技术技术 4.1 4.1 凝胶电泳技术凝胶电泳技术4.1.1 4.1.1 凝胶电泳概述凝胶电泳概述 1.1.定义：定义： 凝胶电泳凝胶电泳是分离鉴定和纯化是分离鉴定和纯化DNADNA片段、检测扩增效果的常用技片段、检测扩增效果的常用技术方法。术方法。v电泳电泳：带电的胶体粒子或分子在电场作用下

2、的定向移动。：带电的胶体粒子或分子在电场作用下的定向移动。v迁移率迁移率：带电颗粒在一定电场中，单位时间内在一定介质中：带电颗粒在一定电场中，单位时间内在一定介质中的迁移距离。它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电的迁移距离。它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。介质的粘度系数等）。 2.2.原理：原理：v通过通过电泳电泳分离提纯生物大分子的分离提纯生物大分子的基本原理基本原理：由于不同生物大：由于不同生物大分子的带电性质不同，分子量大小也不一样，在同一电场条分子

3、的带电性质不同，分子量大小也不一样，在同一电场条件下，其移动方向和迁移率是不同的，因而通过电泳就可把件下，其移动方向和迁移率是不同的，因而通过电泳就可把不同类型的生物大分子分开。不同类型的生物大分子分开。v核酸分子中由于含有离子态的磷酸基团而带负电荷核酸分子中由于含有离子态的磷酸基团而带负电荷( (在生理在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNADNA和和RNARNA实际上呈多聚阴离子状态实际上呈多聚阴离子状态Polyanions)Polyanions)，当核酸分子放置，当核酸分子放置在电场中时，它们会向正电极的方向迁移。在电场中时

4、，它们会向正电极的方向迁移。 由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。小和构型。大分子量的大分子量的DNA移动的慢移动的慢小分子量的小分子量的DNA移动的快移动的快电泳缓冲液电泳缓冲液阳极阳极阴极阴极DNA加样孔加样孔 3.3.电泳的种

5、类：电泳的种类： 按有无固体支持物来分：没有固体支持物的称为自由电按有无固体支持物来分：没有固体支持物的称为自由电泳（如：细胞电泳、柱电泳等）泳（如：细胞电泳、柱电泳等）;常用的有支持物的电泳常用的有支持物的电泳有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺（有淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶）凝胶电泳电泳(PAGE) (PAGE) 、琼脂糖、琼脂糖(agarose)(agarose)凝胶电泳等。凝胶电泳等。 4.1.2 4.1.2 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳应用：应用： 测定测定DNADNA的分子量的分子量 分离大小不同的分离大小不同的DNADNA片段片

6、段 进一步纯化进一步纯化DNADNA 分离鉴定分离鉴定RNA RNA v加标准分子量加标准分子量DNA Marker,测定分子量测定分子量v加标准浓度的加标准浓度的DNA，测定浓度，测定浓度 v琼脂糖由红色海藻产物琼脂提取，将琼脂糖粉末加入琼脂糖由红色海藻产物琼脂提取，将琼脂糖粉末加入TBETBE熔熔解后冷却凝固即成凝胶。解后冷却凝固即成凝胶。v其分辨能力和浓度有关：浓度低，能够分辨大片段其分辨能力和浓度有关：浓度低，能够分辨大片段DNADNA；浓；浓度高，能够分辨小片段（几百度高，能够分辨小片段（几百bpbp）DNADNA。v通过通过EBEB染料染色染料染色DNADNA来检测凝胶中来检测凝胶

7、中DNADNA谱带部位。谱带部位。 EBEB（溴化（溴化乙锭）是一种扁平分子的嵌入性染料，能插入到乙锭）是一种扁平分子的嵌入性染料，能插入到DNADNA分子的分子的相邻碱基之间，并在相邻碱基之间，并在300nm300nm紫外线照射下发出荧光紫外线照射下发出荧光( (肉眼能肉眼能看到约看到约50ng DNA50ng DNA所形成的条带所形成的条带) )。v琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围片段的范围为为0.250kb之间。之间。 琼脂糖凝胶电泳中影响琼脂糖凝胶电泳中影响DNADNA迁移速度的因素：迁移速度的因素：（1 1）DNADNA的分子大小的分子大小 大，慢；小，快大，慢；小

8、，快（2 2）琼脂糖浓度）琼脂糖浓度 高，慢；低，快高，慢；低，快（3 3）DNADNA分子构象分子构象 超螺旋超螺旋 线性线性 开环开环（4 4）电源电压）电源电压 低？高？低？高？（5 5）嵌入染料的存在）嵌入染料的存在（6 6）离子强度影响）离子强度影响 琼脂糖凝胶电泳技术要点琼脂糖凝胶电泳技术要点v1.不同浓度凝胶分辨不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样片段能力不一样 (1)低低: 不利于小片段的分辨不利于小片段的分辨(扩散扩散) (2)高高: 不利于大片段的分辨不利于大片段的分辨(迁移不动迁移不动) (3) 一般选一般选1.0%v2. 凝胶要用缓冲液配凝胶要用缓冲液配( TBE 或或

9、 TAE )v3. EB强致癌，带手套操作；强致癌，带手套操作；v4. agarose (琼脂糖）电泳琼脂糖）电泳 agar(含琼脂糖和琼脂胶）平板培养基含琼脂糖和琼脂胶）平板培养基 琼脂糖水平电泳仪（槽）琼脂糖水平电泳仪（槽） 称样称样溶解溶解加热加热制板制板倒胶倒胶电泳操作基本程序电泳操作基本程序 取样取样点样点样电泳电泳检测检测 结果结果 4.1.3 4.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1 1个碱基对到个碱基对到10001000个个碱基对之间。碱基对之间。 与琼脂糖凝胶电泳比较？与琼脂糖凝胶电泳比较？( (差异）差异） SDS

10、-PAGE 电泳用途电泳用途v1.蛋白分子量的测定蛋白分子量的测定v2.蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定v3.蛋白的鉴定蛋白的鉴定(通过通过1来实现来实现) 小型垂直电泳槽小型垂直电泳槽 SDS-PAGE 电泳原理v1.SDS(带负电带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构和还原剂破坏蛋白的高级结构, 同时同时SDS与蛋白定量结合与蛋白定量结合, 消除蛋白之间的电荷差异消除蛋白之间的电荷差异,使得使得蛋白的蛋白的迁移率主要依赖分子量迁移率主要依赖分子量 ( (分子小跑得快分子小跑得快) .) .v2.2.不连续电泳不连续电泳: : 上层为浓缩胶上层为浓缩胶, ,可将样品压缩到同一起跑可将样品压缩到同一起

11、跑线线, , 下层为分离胶下层为分离胶; ; 可获得更高的分辨率可获得更高的分辨率. .v3.3.考马斯亮蓝进行染色考马斯亮蓝进行染色. . SDS-PAGE 技术要点1、浓缩胶一般用、浓缩胶一般用5%, 分离胶分离胶:次高分子次高分子(10万万-20 万万)用用7%, 低分子低分子(1.4万万10万）用万）用122、PAGE配制时带手套，（配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，液体有积累性神经毒，聚合后无毒聚合后无毒)3、SDSPAGE测定的是单体蛋白分子量（多亚基不行）测定的是单体蛋白分子量（多亚基不行）4、SDSPAGE不适于：不适于： （1）电荷异常蛋白：组蛋白（电多）电荷

12、异常蛋白：组蛋白（电多） （2）构象异常的）构象异常的 蛋白蛋白 （3）带有较大辅基的蛋白糖蛋白，脂蛋白。）带有较大辅基的蛋白糖蛋白，脂蛋白。 4.2 4.2 核酸的提取和纯化核酸的提取和纯化1 1 核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则1.1 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性1.2. 1.2. 防止核酸的生防止核酸的生物降物降解、去除杂质解、去除杂质 2 2 分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤2.1 2.1 细胞的破碎细胞的破碎2.2 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除2.3 2.3 核酸的沉淀核酸的沉淀2.4 2.4 核

13、酸的浓度测定核酸的浓度测定2.5 2.5 核酸的保存核酸的保存3 3 基因组基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒DNADNA的提取纯化的提取纯化 核酸核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。基因表达的物质基础。 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸进行分离和纯化。 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 1 核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则1.1 1.1 保持核酸分子一级结构的完整性保持核酸分子一级结构的完整性1.1.1

14、1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的级级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。方式。1.1.2 1.1.2 操作注意事项：操作注意事项： 1 1）温度不要过高；）温度不要过高； 2 2）控制）控制pHpH值范围值范围(pH(pH值值5-9); 5-9); 3 3）保持一定离子强度）保持一定离子强度; ; 4 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力）减少物理因素对核酸的机械剪切力. . 1.2 防止核酸的生物降解、去除杂质防止核酸的生物降解、去除杂质 细胞内或外来的

15、各种核酸酶能消化核酸链中的细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。中需加核酸酶抑制剂。 1.2.1 DNA酶抑制剂酶抑制剂(1(1） 金属离子螯合剂：金属离子螯合剂： DNADNA酶需要金属二价离子酶需要金属二价离子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因此使用金属的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制二价离子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTA-NaEDTA-Na2 2( (乙二胺四乙乙二胺四乙酸二钠酸二钠

16、) )、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；(2(2） 阴离子型表面活性剂：阴离子型表面活性剂： 如如SDSSDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。高盐溶液中沉淀。 1.2.2 RNA酶（酶（RNAase)抑制剂抑制剂 RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附作用机制：

17、皂土带负电荷，能吸附RNAase，使其失活。，使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。 作用机制：与蛋白质中作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。结合使蛋白变性。 使用注意：使用注意： 1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大白质变性的浓度大1001000倍。倍。 2）容易降解，保存在）容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中； 3）提）提RNA时，时，0.1% DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2

18、h。 4）剧毒。）剧毒。 （3) 3) 肝素肝素（4 4）复合硅酸盐（）复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧钒核糖核苷复合物）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)Complex, VRC) (1) (1) 高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎 (2) (2) 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 (3) (3) 超声波处理法超声波处理法 (4) (4) 液氮研磨法液氮研磨法 (5) (5) 化学处理

19、法化学处理法(SDS(SDS、LDSLDS，吐温，吐温8080等）等） (6) (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2.1 细胞的破碎细胞的破碎2 分离提取核酸的主要步骤分离提取核酸的主要步骤 2.2 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力( (核酸与核酸与碱性蛋白的结合碱性蛋白的结合) )、氢键和非极性的范德华力。、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。同时避免

20、核酸降解。 2.2.1 加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl） 核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；核蛋白解聚； 2.2.2 加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；白质上游离出来的功能； 2. 2.3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水氯仿比重大，能加速有机相与水相分

21、层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇氯：异戊醇=25=25：2424：1 1）。）。 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变

22、色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酸二酯键。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意: 2.3 核酸的沉淀核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：优点： 改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。 2.3.1 2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐

23、盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3 (pH5.2)0.3KAc3 (pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 当核酸溶液的当核酸溶液的pHpH值大于值大于4 4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与与1 1价或价或2 2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。有机溶剂变性。 2.3.2 有机沉淀剂有机沉淀剂 （1 1）乙醇）乙醇优点：优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，对盐类沉淀少，沉淀中所含

24、迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。不影响以后实验。缺点：缺点： 需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。 （2）异丙醇）异丙醇优点：优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样样品沉淀。一般不需低温长时间放置。品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：缺点： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥发除共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用去。所以，最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。 （3）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEG）优点：优点： 可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量

25、的选择沉淀不同相对分子质量的DNADNA片段。应用片段。应用60006000相对分子质量的相对分子质量的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，沉淀时，使用浓度与使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol/L10 mmol/L的的MgClMgCl2 2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。 （4 4）精胺）精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺与精胺与DNADNA结合后，

26、使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝缩而发在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNADNA分开，分开，达到纯化达到纯化DNADNA的目的。的目的。 2.3.3 2.3.3 核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀，影响以后的共沉淀，影响以后的实验。一般使用实验。一般使用00冰水，冰水，10-15min10-15min， DNADNA样品足样品足可达到实验要求。可达到实验要求。 2.4 2.4

27、 核酸的浓度测定核酸的浓度测定 2.4.1 2.4.1 紫外分光光度法测紫外分光光度法测DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。其他核酸污染。测定浓度应大于测定浓度应大于0.25 g/ml 。 结论：在波长结论：在波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度相当于值的吸光度相当于双链双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 g/ml37 g/ml；RNARNA为为40 40 ug/mlug/ml。 紫外分光光度计测

28、定核酸浓度的操作步骤紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加水至特定体积后，转入样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。分光光度计的石英比色杯中。b b分光光度计先用一定量的水校正零点。分光光度计先用一定量的水校正零点。c c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d计算浓度。计算浓度。 双链双链DNADNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数 50/100050/1000； R

29、NARNA样品浓度样品浓度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40/100040/1000。e e分析纯度。分析纯度。 A：测：测DNA： 纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应应大于大于2.0。1) OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。杂质，如核苷酸

30、、氨基酸、酚等。注：注： 可能出现既含蛋白质又含可能出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比值为溶液比值为1.8的情的情况。况。 测定结果分析测定结果分析 B B：测：测RNARNA 纯的纯的RNARNA样品其样品其OD260OD260OD280OD280应介于应介于1.7-2.01.7-2.0之间，之间，OD260/OD230OD260/OD230比值应大于比值应大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；污染；2 2）比值大于）比值大于2.02.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时

31、，可能被异硫氰酸胍等污染；3 3）OD260/OD230OD260/OD230比值小于比值小于2.02.0时表明有小分子及盐存在。时表明有小分子及盐存在。 2.4.2 2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量溴乙锭荧光法测定核酸的含量 原理原理：DNADNA、RNARNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基平面之间后，嵌入碱基平面之间后，DNADNA、RNARNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNADNA溶液作溶液作标准对照，可比较出被

32、测标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 2.5 核酸的保存核酸的保存(1) (1) 对对DNADNA DNA DNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保存；保存； 长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 对对RNA RNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，或双蒸灭菌水中，-70 -70 保存保存; ; 长期保存

33、可以沉淀形式贮于乙醇中长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ; 在在RNARNA溶液中，加溶液中，加1 1滴滴0.2 mol/L VRC(0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合氧钒核糖核苷复合物物) )冻贮于冻贮于-70,-70,可保存数年。可保存数年。3 3 基因组基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒DNADNA的提取纯化的提取纯化3.1 3.1 基因组基因组DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 基因组基因组DNADNA的提取通常用于构建基因组文库、的提取通常用于构建基因组文库、SouthernSouthern杂交杂交( (包括包括RFLP)RFLP)及及PCRPCR分离基因等。利

34、用基因组分离基因等。利用基因组DNADNA较较长的特性长的特性, ,可以将其与细胞器或质粒等小分子可以将其与细胞器或质粒等小分子DNADNA分离。分离。提取方法：提取方法：v核酸从核酸从cellcell中释放出来的方式：中释放出来的方式：研磨研磨 超声波超声波 匀浆匀浆 冻溶冻溶 溶菌酶溶菌酶 v加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNADNA即沉淀形即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中成纤维状絮团飘浮其中, , 可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子DNADNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, , 从而达到提

35、取的目的。从而达到提取的目的。注意事项注意事项：v（1 1）在提取过程中）在提取过程中, ,染色体会发生机械断裂染色体会发生机械断裂, ,产生大小不同的产生大小不同的片段片段, ,因此分离基因组因此分离基因组DNADNA时应尽量在温和的条件下操作时应尽量在温和的条件下操作, ,如尽如尽量减少酚量减少酚/ /氯仿抽提、混匀过程要轻缓氯仿抽提、混匀过程要轻缓, , 以保证得到较长的以保证得到较长的DNADNA。v（2 2）一般来说）一般来说, ,构建基因组文库构建基因组文库, , 初始初始DNADNA长度必须在长度必须在100kb100kb以上以上, ,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而

36、进行否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLPRFLP和和PCRPCR分析分析, DNA, DNA长度可短至长度可短至50kb, 50kb, 在该长度以上在该长度以上, ,可保可保证酶切后产生证酶切后产生RFLPRFLP片段片段(20kb(20kb以下以下),),并可保证包含并可保证包含PCRPCR所扩增所扩增的片段的片段( (一般一般2kb2kb以下以下) )。 v（3 3）不同生物（植物、动物、微生物）的基因组）不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNADNA的提取的提取方法有所不同方法有所不同; ; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结不同种类或同一种类的不同组织因其细

37、胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。构及所含的成分不同，分离方法也有差异。v（4 4）在提取某种特殊组织的）在提取某种特殊组织的DNADNA时必须参照文献和经验建立时必须参照文献和经验建立相应的提取方法相应的提取方法, , 以获得可用的以获得可用的DNADNA大分子。尤其是组织中的大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、多糖和酶类物质对随后的酶切、PCRPCR反应等有较强的抑制作用反应等有较强的抑制作用, ,因此用富含这类物质的材料提取基因组因此用富含这类物质的材料提取基因组DNADNA时时, , 应考虑除去多应考虑除去多糖和酚类物质。糖和酚类物质。 提取步骤提取步骤（以植物为

38、例）（以植物为例）v在在50ml50ml离心管中加入离心管中加入20ml20ml提取缓冲液提取缓冲液, 60, 60水浴预热。水浴预热。 v植物幼苗或叶子植物幼苗或叶子5-10g, 5-10g, 剪碎剪碎, , 在研钵中加液氮磨成粉状后在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中立即倒入预热的离心管中, , 剧烈摇动混匀剧烈摇动混匀, 60, 60水浴保温水浴保温30-6030-60分钟分钟( (时间长时间长,DNA,DNA产量高产量高), ), 不时摇动。不时摇动。 v加入加入20ml20ml氯仿氯仿/ /戊醇戊醇/ /乙醇溶液乙醇溶液, , 颠倒混匀颠倒混匀( (需带手套需带手套, ,

39、防止防止损伤皮肤损伤皮肤) )，室温下静置，室温下静置5-105-10分钟分钟, , 使水相和有机相分层使水相和有机相分层( (必必要时可重新混匀要时可重新混匀) )。 v室温下室温下5000rpm5000rpm离心离心5 5分钟。分钟。 v仔细移取上清液至另一仔细移取上清液至另一50ml50ml离心管离心管, ,加入加入1 1倍体积异丙醇倍体积异丙醇, ,混混匀匀, ,室温下放置片刻即出现絮状室温下放置片刻即出现絮状DNADNA沉淀。沉淀。v在在1.5ml eppendorf1.5ml eppendorf中加入中加入1ml TE1ml TE。用钩状玻璃棒捞出。用钩状玻璃棒捞出DNADNA絮絮

40、团团, ,在干净吸水纸上吸干在干净吸水纸上吸干, ,转入含转入含TETE的离心管中的离心管中,DNA,DNA很快溶解很快溶解于于TETE。 v如如DNADNA不形成絮状沉淀不形成絮状沉淀, ,则可用则可用5000rpm5000rpm离心离心5 5分钟分钟, , 再将沉淀再将沉淀移入移入TETE管中。这样收集的沉淀管中。这样收集的沉淀, ,往往难溶解于往往难溶解于TE,TE,可在可在6060水水浴放置浴放置1515分钟以上，以帮助溶解。分钟以上，以帮助溶解。v将将DNADNA溶液溶液3000rpm3000rpm离心离心5 5分钟分钟, , 上清液倒入干净的上清液倒入干净的5ml5ml离心管。离心

41、管。v加入加入5l RNaseA(10g/l), 37 105l RNaseA(10g/l), 37 10分钟分钟, , 除去除去RNA(RNARNA(RNA对对DNADNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 v加入加入1/101/10体积的体积的3mol/L NaAc3mol/L NaAc及及2 2体积的冰乙醇体积的冰乙醇, ,混匀混匀,-20,-20放置放置2020分钟左右分钟左右,DNA,DNA形成絮状沉淀。形成絮状沉淀。v用玻棒捞出用玻棒捞出DNADNA沉淀沉淀,70%,70%乙醇漂洗乙醇漂洗, ,再在干净吸水纸上吸干。再在干净吸水纸上吸干

42、。 v将将DNADNA重新溶解于重新溶解于1ml TE, -201ml TE, -20贮存。贮存。 v 纯化方法纯化方法：v如果如果DNADNA中所含杂质多中所含杂质多, , 不能完全酶切不能完全酶切, , 或小分子或小分子DNADNA多多, , 会会影响后续的分析和操作影响后续的分析和操作, ,可以用下列方法纯化：可以用下列方法纯化： （1 1）选用幼嫩组织，可减少淀粉类的含量。）选用幼嫩组织，可减少淀粉类的含量。 （2 2）酚）酚: :氯仿抽提氯仿抽提, , 去除蛋白质和多糖。去除蛋白质和多糖。 （3 3）SepharoseSepharose柱过滤柱过滤, , 去除酚类、多糖和小分子去除酚

43、类、多糖和小分子DNADNA。 （4 4）CsClCsCl梯度离心梯度离心, , 去除杂质去除杂质, , 分离大片段分离大片段DNA(DNA(可用作文库构可用作文库构建建) )。 3.2 RNA3.2 RNA（mRNAmRNA）提取和纯化）提取和纯化 关键因素关键因素：抑制：抑制RNARNA酶的活性酶的活性 两条途径两条途径：提取多聚核糖体，利用抗原抗体反应，得到提取多聚核糖体，利用抗原抗体反应，得到mRNAmRNA提取总提取总RNA - Oligo(dT)-RNA - Oligo(dT)-纤维柱层析纤维柱层析- - 将将mRNAmRNA与其与其它它RNARNA分开分开 注意事项注意事项器皿都

44、要严格消毒器皿都要严格消毒 要加要加RNARNA酶的抑制剂酶的抑制剂( (焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)(DEPC)(DEPC) 戴塑料手套戴塑料手套v模板模板mRNAmRNA的质量直接影响到的质量直接影响到cDNAcDNA合成的效率。由于合成的效率。由于mRNAmRNA分分子的结构特点子的结构特点, ,容易受容易受RNARNA酶的攻击反应而降解酶的攻击反应而降解, ,加上加上RNARNA酶酶极为稳定且广泛存在极为稳定且广泛存在, ,因而在提取过程中要严格防止因而在提取过程中要严格防止RNARNA酶酶的污染的污染, ,并设法抑制其活性并设法抑制其活性, ,这是本实验成败的关键。所有这是本实验成败的

45、关键。所有的组织中均存在的组织中均存在RNARNA酶酶, ,人的皮肤、手指、试剂、容器等均人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。更换（使用一次性手套）。 v所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200200烘烤烘烤2 2小时以上。小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%0.1%的焦的焦碳酸二乙酯碳酸二乙酯(DEPC)(DEPC)水溶液处理水溶液处理, ,再用蒸馏水冲净。再用蒸馏水冲净。DEPCDE

46、PC是是RNARNA酶的化学修饰剂酶的化学修饰剂, ,它和它和RNARNA酶的活性基团组氨酸的咪唑酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。环反应而抑制酶活性。DEPCDEPC与氨水溶液混合会产生致癌物与氨水溶液混合会产生致癌物, ,因而使用时需小心。因而使用时需小心。 v细胞内总细胞内总RNARNA制备方法很多制备方法很多, ,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总公司有现成的总RNARNA提取试剂盒提取试剂盒, ,可快速有效地提取到高质量可快速有效地提取到高质量的总的总RNARNA。v分离的总分离的总RNARNA可利用可利用mRNA 3mRNA 3末端含有

47、多聚末端含有多聚(A)+ (A)+ 的特点的特点, ,当当RNARNA流经流经oligo (dT)oligo (dT)纤维素柱时纤维素柱时, ,在高盐缓冲液作用下在高盐缓冲液作用下,mRNA,mRNA被特被特异的吸附在异的吸附在oligo(dT)oligo(dT)纤维素上纤维素上, ,然后逐渐降低盐浓度洗脱然后逐渐降低盐浓度洗脱, ,在在低盐溶液或蒸馏水中低盐溶液或蒸馏水中,mRNA,mRNA被洗下。经过两次被洗下。经过两次oligo(dT)oligo(dT)纤维纤维素柱素柱, ,可得到较纯的可得到较纯的mRNAmRNA。v纯化的纯化的mRNAmRNA在在70%70%乙醇中乙醇中-70-70可

48、保存一年以上。可保存一年以上。 v从真核生物的组织或细胞中提取从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,mRNA,通过酶促反应逆转录合通过酶促反应逆转录合成成cDNAcDNA的第一链和第二链的第一链和第二链, ,将双链将双链cDNAcDNA和载体连接和载体连接, ,然后转化然后转化扩增扩增, , 即可获得即可获得cDNAcDNA文库文库, ,构建的构建的cDNAcDNA文库可用于真核生物基文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析因的结构、表达和调控的分析; ;比较比较cDNAcDNA和相应基因组和相应基因组DNADNA序序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。列差异可确定内含子

49、存在和了解转录后加工等一系列问题。vcDNAcDNA合成及克隆的合成及克隆的基本步骤基本步骤包括：用反转录酶合成包括：用反转录酶合成cDNAcDNA第一第一链链, ,聚合酶合成聚合酶合成cDNAcDNA第二链第二链, ,加入合成接头以及将双链加入合成接头以及将双链DNADNA克隆克隆到于适当载体到于适当载体( (噬菌体或质粒噬菌体或质粒) )。3.3 3.3 质粒质粒DNADNA的分离、纯化的分离、纯化 （一）质粒特性（一）质粒特性v质粒质粒(Plasmid)(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子是一种染色体外的稳定遗传因子, ,大小从大小从1-1-200kb200kb不等不等, ,为

50、双链、闭环的为双链、闭环的DNADNA分子分子, ,并以超螺旋状态存在并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。于宿主细胞中。v质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力复制和转录能力, ,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数能在子代细胞中保持恒定的拷贝数, ,并表并表达所携带的遗传信息。达所携带的遗传信息。 v质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活如离开宿主细胞则不能存活, ,而宿主即使没有它们也可以正而宿主即使没有它们也可以正常存活。常存活。

51、v质粒的存在使宿主具有一些额外的特性质粒的存在使宿主具有一些额外的特性, ,如对抗生素的抗性如对抗生素的抗性等。等。F F质粒质粒( (又称又称F F因子或性质粒因子或性质粒) )、R R质粒质粒( (抗药性因子抗药性因子) )和和ColCol质粒质粒( (产大肠杆菌素因子产大肠杆菌素因子) )等都是常见的天然质粒。等都是常见的天然质粒。 v质粒在细胞内的复制一般有两种类型质粒在细胞内的复制一般有两种类型: :紧密控制型紧密控制型(Stringent (Stringent control)control)和松驰控制型和松驰控制型(Relaxed control)(Relaxed control

52、)。前者只在细胞周。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制期的一定阶段进行复制, ,当染色体不复制时当染色体不复制时, ,它也不能复制它也不能复制, ,通通常每个细胞内只含有常每个细胞内只含有1 1个或几个质粒分子个或几个质粒分子, ,如如F F因子。后者的质因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制粒在整个细胞周期中随时可以复制, ,在每个细胞中有许多拷贝在每个细胞中有许多拷贝, ,一般在一般在2020个以上个以上, ,如如Col E1Col E1质粒。质粒。 v把一个有用的目的把一个有用的目的DNADNA片段通过重组片段通过重组DNADNA技术技术, ,送进受体细送进受体细胞中去进行繁殖和表

53、达的工具叫胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体载体(Vector)(Vector)。细菌质粒。细菌质粒是重组是重组DNADNA技术中常用的载体。技术中常用的载体。v质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比人工构建的。与天然质粒相比, ,质粒载体通常带有一个或质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因一个以上的选择性标记基因( (如抗生素抗性基因如抗生素抗性基因) )和一个人和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列列, ,并去掉了大部分非必需

54、序列并去掉了大部分非必需序列, ,使分子量尽可能减少使分子量尽可能减少, ,以以便于基因工程操作。便于基因工程操作。 v一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性： （1 1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；）分子量小、多拷贝、松驰控制型； （2 2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；）具有多种常用的限制性内切酶的单切点； （3 3）能插入较大的外源）能插入较大的外源DNADNA片段；片段； （4 4）具有容易操作的检测表型。）具有容易操作的检测表型。 常用的质粒载体大小一般在常用的质粒载体大小一般在1kb1kb至至10kb10kb之间，如之间，如PBR32

55、2PBR322、 PUCPUC系列、系列、PGEMPGEM系列和系列和pBluescriptpBluescript（简称（简称pBSpBS）等。）等。 （二）质粒（二）质粒DNADNA的分离的分离 从细菌中分离质粒从细菌中分离质粒DNADNA的方法包括的方法包括3 3个基本步骤个基本步骤：（1 1）培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；（2 2）收集和裂解细胞）收集和裂解细胞; ;（3 3）分离和纯化质粒）分离和纯化质粒DNADNA。 v采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁, ,十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)和和Triton Triton X-100X-

56、100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDSSDS或或Triton X-100Triton X-100处理后处理后, ,细细菌染色体菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎片上会缠绕附着在细胞碎片上, ,同时由于细菌染色体同时由于细菌染色体DNADNA比比质粒大得多质粒大得多, ,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNADNA变性变性, ,而共价闭合环状而共价闭合环状DNA(Covalently closed circu

57、lar DNADNA(Covalently closed circular DNA，简称，简称cccDNA)cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体色体DNADNA片段难以复性片段难以复性, ,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起起, ,而质粒而质粒DNADNA双链又恢复原状双链又恢复原状, ,重新形成天然的超螺旋分子重新形成天然的超螺旋分子, ,并以并以溶解状态存在于液相中。溶解状态存在于液相中。 v在提取质粒过程中，除了超螺旋在提取质粒过程中，除了超螺旋DNADNA外，还会产

58、生其它外，还会产生其它形式的质粒形式的质粒DNADNA。如果质粒。如果质粒DNADNA两条链中有一条链发生一两条链中有一条链发生一处或多处断裂处或多处断裂, ,分子就能旋转而消除链的张力分子就能旋转而消除链的张力, ,形成松驰形成松驰型的环状分子型的环状分子, ,称开环称开环DNA(Open circular DNA, DNA(Open circular DNA, 简称简称 ocDNA)ocDNA)；如果质粒；如果质粒DNADNA的两条链在同一处断裂的两条链在同一处断裂, ,则形成线则形成线状状DNA(Linear DNA)DNA(Linear DNA)。当提取的质粒。当提取的质粒DNADNA

59、电泳时电泳时, ,同一质同一质粒粒DNADNA其超螺旋形式的泳动速度要比线状和开环分子的其超螺旋形式的泳动速度要比线状和开环分子的泳动速度快。（泳动速度快。（cccDNA cccDNA LDNA LDNA ocDNAocDNA ）4.3 DNA4.3 DNA测序技术测序技术v4.3.1 4.3.1 双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法 基本原理：基本原理：vDNADNA聚合酶能够利用单链聚合酶能够利用单链DNADNA作模板，合成互补链。作模板，合成互补链。vDNADNA聚合酶能够利用聚合酶能够利用2,3-2,3-双脱氧核苷三磷酸作底物，将双脱氧核苷三磷酸作底物，将其掺入到寡核苷酸链的其掺入到寡

60、核苷酸链的33末端，从而终止末端，从而终止DNADNA链的生长。链的生长。v反应体系：模板反应体系：模板DNADNA、放射性标记的引物、放射性标记的引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、4 4种种dNTPdNTP和一种和一种ddNTP.ddNTP. 末端终止原理：在末端终止原理：在DNADNA测序反应中，加入模板测序反应中，加入模板DNADNA、特异性引物、特异性引物、DNADNA聚合酶、聚合酶、dATPdATP、dTTPdTTP、dGTPdGTP、dCTPdCTP和一种和一种ddNTPddNTP，当这种，当这种2,3-2,3-双脱氧双脱氧ddNTPddNTP掺入到寡核苷酸链生长末端，取代了相应的