甲壳动物酚氧化酶原激活系统

1、甲壳动物酚氧化酶原激活系统1 概述甲壳动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的非特异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。非特异性免疫系统是一种比较原始的免疫系统，它存在于所有多细胞生物体，是免疫防御的第一线，分为细胞免疫和体液免疫。甲壳动物的细胞免疫包括吞噬作用、包围化及结节的形成；体液免疫包括酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase activating system, proPO系统)、各种凝集素及抗菌肽等。proPO系统是一种类似于脊椎动物补体系统的酶级联系统，在甲壳动物的非特异性免疫系统中起着非常重要的作用。它由酚氧化酶(phenoloxidase

2、, PO)、酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)、丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)、模式识别蛋白(patten recognition proteins，PRPs)和蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor)等构成。该系统中的因子以非活化状态存在于血颗粒细胞中，极微量的微生物多糖如 -1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan , PGN)等和钙离子、胰蛋白、SDS可激活该系统，使proPO 变成PO，并产生一系列有生理活性的物

3、质，通过包囊与黑化作用抑制和杀死病原体，达到免疫效果。另外其在表皮硬化和伤口愈合中也发挥着重要的作用。2 proPO激活系统相关因子2.1 模式识别蛋白(patten recognition proteins，PRPs)无脊椎动物行使非特异性免疫反应首先是通过体内特定蛋白对病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen- associated molecular patterns , RAMPs)，包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、革兰氏阳性菌的肽聚糖(peptidoglycan , PGN)及真菌的-1,3-葡聚糖(-1,3-glucans, G

4、)进行识别，这种特定蛋白就称为模式识别蛋白(patten recognition proteins，PRPs)。PRPs包括肽聚糖识别蛋白(the peptidoglycan-recognition proteins, PGRPs)、革兰氏阳性菌结合蛋白(Gram-negative-binding proteins, GNBPs)、-葡聚糖结合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)、脂多糖和-1,3-葡聚糖结合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)、C型凝集素(C-type lectins)、Toll样受体(

5、Toll-like receptors)。Toll样受体虽然在脊椎动物中作为一种模式识别受体发挥作用,但是在无脊椎动物中这类受体并不与病原体直接接触,而是作为一种跨膜的信号转导分子行使功能。通常情况下PRPs在异物入侵前位于血浆或血细胞表面，具有对多糖的亲和性。当微生物感染生物体时，PRPs 首先与微生物细胞壁上的多糖结合，然后通过与血细胞表面特异受体联结促进颗粒细胞扩张，引发包裹、吞噬、proPO 系统级联发应等，实施机体的非特异性免疫反应。2.1.1 -葡聚糖结合蛋白(-glucan-binding proteins, GBPs)1992 年，Duvic B等从淡水螯虾(Pacifasta

6、cus leniusculus)血细胞中纯化到GBP 结合蛋白，并对其部分特性进行研究。GBP在肝胰腺转录，其编码的蛋白被释放到血淋巴中，并与-1,3-葡聚糖结合，促进proPO系统的激活。从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)分离获得与淡水螯虾(P.leniusculus)GBP相似的蛋白，其氨基酸序列与GBP相似性约为70%，被命名为GBP-HDL。GBP/GBP-HDL家族包含两个与微生物葡聚糖酶催化域序列相似性很高的基序，但是它们不具有葡聚糖酶活性，而具有整合蛋白基序作为假定的细胞粘附位点。已从加州对虾(

7、Penaeus californiensis)、细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)、凡纳滨对虾(L.vannamei)和中国明对虾(F.chinensis)分离并克隆了GBP/GBP-HDL家族基因。凡纳滨对虾(L.vannamei) GBP-HDL在肝胰腺、肌肉、游泳足和鳃中表达，在血细胞中不表达；中国明对虾(F.chinensis) GBP-HDL在肠、肝胰腺、肌肉和鳃和血细胞中均有表达，且在感染白斑综合症病毒后其表达情况发生改变。尽管对虾GBP-HDL mRNA在多种组织中均有转录，但GBP-HDL蛋白仅存在于血淋巴中。在-1,3-葡聚糖存在的下，分离纯化的G

8、BP能够激活加州对虾(P.californiensis)酚氧化酶活性，因此GBP-HDL可能是对虾proPO激活路径中识别-1,3-葡聚糖的一种模式识别蛋白。2.1.2 脂多糖和-1,3-葡聚糖结合蛋白(LPS and -1,3-glucan-binding proteins, LGBPs)LGBPs最初从淡水螯虾(P.leniusculus)分离获得，与昆虫GNBPs具有较高的同源性，LGBPs与LPS或-1,3-葡聚糖的结合能够激活proPO系统。目前已克隆获得淡水螯虾(P.leniusculus)、凡纳滨对虾(L.vannamei)、中国明对虾(F.chinensis)、日本囊对虾(Ma

9、rsupenaeus japonicus)和斑节对虾(Penaeus monodon) LGBPs基因。大多数LGBP成熟蛋白的平均分子量为39.840.2kDa，含有一个由多聚糖结合基序、葡聚糖酶基序、-葡聚糖识别基序以及两个精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸基序。LGBP mRNA主要在血细胞中表达，在感染白斑综合症病毒或革兰氏阴性菌及其脂多糖早期中期，LGBP mRNA表达水平上调，表明LGBP是一种与免疫应答有关的基因。2.1.3 C型凝集素(C-type lectins)C型凝集素是糖类结合蛋白，在脊椎动物和无脊椎动物的生物过程中具有重要作用。Changlin Chen首次在蟑螂报道了凝集素与

10、proPO系统的联系，分离纯化的血清凝集素能够激活蟑螂血淋巴的proPO系统，并能增强海带多糖对proPO系统的激活。在烟草天蛾发现了两种C型凝集素，分别命名为IML-1和IML-2，被认为是昆虫血淋巴proPO系统激活所需要的模式识别蛋白。近期，在淡水螯虾(P.leniusculus)证明了C型凝集素与proPO系统激活之间的联系。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)C型凝集素PcLec2是参与proPO系统激活的一种模式识别蛋白，同时，淡水螯虾(P.leniusculus)C型凝集素甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, Pl- MBL)在颗粒细胞

11、中合成，在受到感染后通过胞吐作用排出，具有调节proPO系统的作用。已从对虾中鉴定了一些C型凝集素并对其生化特征予以描述，但有关其在对虾proPO系统激活中的潜在作用却知之甚少。近期有研究表明，凡纳滨对虾(L.vannamei)C型凝集素能增强血淋巴中酚氧化酶的活性。然而，对虾proPO系统激活的分子机制还有待进一步阐明。2.2丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)丝氨酸蛋白酶(serine proteinases, SPs)是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，不仅参与机体消化、胚胎发育、组织重建、细胞分化及血管形成等过程，而且在抵御病原体入侵的过程中起着非常重要的作

12、用。参与免疫反应的SPs 通常以酶原的形式合成，储存在膜泡内或颗粒中，然后被转运或释放到细胞外，通过与特异的蛋白酶结合，在其活性位点水解断裂，使之活化，形成级联反应，并快速启动相应的免疫防御系统，抵御病原体的感染。丝氨酸蛋白酶的活性部位都含有组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，形成催化三联体。目前，已在昆虫和甲壳动物中发现了几种参与proPO系统激活的SPs，它们都属于含有发夹结构域的丝氨酸蛋白酶 (Clip-domain serine proteinase , Clip-SPs)。 Clip-SPs通常以酶原的形式合成，其N端具有12个Clip结构域，C端起催化作用的SP结构域。Clip结构域通常由3

13、755个氨基酸残基组成，并通过3 个严格保守的二硫键相互连接，形成紧凑结构，进而通过2392 个氨基酸残基与SP 结构域连接。Clip-SPs分为具催化活性的SPs和无催化活性的SPs丝氨酸蛋白酶同源物(Clip-SP homologs, Clip-SPHs)，二者的氨基酸序列相似，但Clip-SPHs由于一个或多个催化残基的缺失或突变导致其明显缺乏酰胺酶活力(如：Clip-SPHs催化三联体中的丝氨酸被甘氨酸取代)，目前已有文献证实，SPHs在节肢动物中参与酚氧化酶原系统的激活和抗微生物应答。Rattanachai 等(2005)从日本囊对虾中克隆到了一个SPHs 基因, 发现基因的表达量在

14、投喂含有肽聚糖的饵料后有显著增加；Jitvaropas等(2009)从斑节对虾的血淋巴细胞中克隆得到了一个SPHs 基因, 经过分子克隆和体外表达获得的蛋白具有细胞粘附、抑菌等生物学活性；杨燚等(2012)从中国明对虾血细胞中克隆获得了一个SPHs基因, 细菌和对虾白斑综合症病毒(WSSV)刺激后该基因在血细胞中的表达会显著上调。已证明，当没有SPHs时，proPO能够被PAP在正确的位置裂解，但是却不能显现PO的活性。因此有人推断，SPs和SPHs的发夹结构域似乎对proPO的活化作用很关键，SPHs很可能改变了PO的构象而导致其活化，但目前SPHs与PO之间的直接反应关系还没有被确认。2.

15、3酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和酚氧化酶原(Prophenoloxidase, proPO)酚氧化酶(phenoloxidase, PO)又称为酪氨酸酶(tyrosinase)，在无脊椎动物和脊椎动物中都有发现，其活性部位是由2个铜原子(CuA和CuB)，能够催化酚类物质形成最终的反应产物黑色素。无脊椎动物 PO 一般以无活性状态的proPO存在，ProPO产生于血淋巴中成熟的血细胞，如颗粒细胞和半颗粒细胞，经丝氨酸蛋白酶裂解变成有活性的 PO。1996 年，Sugumaran建议：酪氨酸酶这个名字应专门用于哺乳类，而 PO 专门用于无脊椎动物。FujimotoK对它们进行序

16、列分析，结果显示它们来源于两个相对独立的分支，从序列相似性考虑，酪氨酸酶可能起源于软体动物的血蓝蛋白，PO 可能起源于节肢动物的血蓝蛋白。PO能够催化单酚羟化成二酚，并把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。这些黑色素协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围，起到隔离杀死病原体的作用，即所谓的黑化包被反应。在较高等的无脊椎动物如节肢动物中，PO 具有多种功能，它不仅参与黑色素形成、角质的硬化和伤口愈合，而且在宿主的防御反应中还作为非自身识别系统发挥功能，在识别异物、释放调理素(opsonin)、促进血细胞的吞噬和包囊反应以及促进颗粒细胞和半颗粒细胞释放颗粒、产生多

17、种介导凝集因子及抗菌肽等免疫功能方面发挥着重要的作用。PO活力的强弱与机体的免疫力直接相关，可作为衡量甲壳动物免疫功能大小的指标之一。目前，许多甲壳类proPO 的cDNA 序列已被克隆并测序，如罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、锯缘青蟹(Scylla serrata)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus)、斑节对虾(P.monodon)、凡纳滨对虾(L.vannamei)、日本囊对虾(M.japonicus)及中国明对虾(F.chinensis)等。甲壳动物proPO 的cDNA序列长约2500bp，如锯缘青蟹(S.serrata)proPO 的

18、cDNA 序列为2663 bp，南美白对虾的为2471 bp，序列中含有高度保守的两个铜结合位点，即5 个糖基化位点和6 个组氨酸残基，整个序列没有信号肽。ProPO 经丝氨酸蛋白酶裂解转变为具活性的PO，一般会有一段约50 个氨基酸的肽链从proPO 上切除。而这个酶切位点及其周围的氨基酸序列在同一物种中也是非常保守的，如淡水螯虾(P. Leniusculus)的酶切位点在Arg176-Thr177，斑节对虾(P.monodon)的酶切位点在Arg44- Val45。2.4血蓝蛋白(hemocyanin)甲壳动物血蓝蛋白是一类含有铜离子的寡聚蛋白，起着运送氧的重要功能。但是，最近的研究发现，

19、在一定条件下血蓝蛋白具有PO的活性。虽然体内血蓝蛋白是否具有PO活性尚无证据，但血蓝蛋白体在外添加SDS、胰蛋白酶、-1,3-葡聚糖和血细胞粗提物的混合物时能显示PO活性。血蓝蛋白和PO 虽然在结构上有相似点，如两者都是含双铜的蛋白，这两个铜位点就是它们的活性部位，且都分别与三个组氨酸残基连在一起。但是，两者却有着许多不同点，如它们的生成器官是不同的，血蓝蛋白在肝胰腺中生成，而proPO 在成熟血细胞中生成。另外，将螯虾的PO 与血蓝蛋白进行理化特性比较发现，血蓝蛋白的表面带有较多的负电并较PO 的疏水性弱，血蓝蛋白有信号肽，而PO 没有信号肽。对血蓝蛋白结构的研究发现，当血蓝蛋白执行携氧功能

20、时，由于一些重要的氨基酸残基的阻挡，其活性部位只允许氧分子进入，酚类底物不能进入。对螯虾、黄道蟹(Cancer magister)等的研究表明，在血蓝蛋白的N末端发生蛋白质水解或将氨基酸残基拉出活性部位使其结构改变或部分展开后，血蓝蛋白的铜位点能与更大的底物，如酚类物质结合，从而使之具有PO功能，完成黑化。2.5 其他proPO系统相关因子ProPO 通过粒细胞内小泡胞吐的形式排到血浆中，同时被胞吐外排的还有过氧素(peroxinectin)，Masquerade-like 蛋白，抗菌肽，转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase)等，因而ProPO 系统的激活也影响了其它的

21、免疫反应，而且这些免疫反应之间又是彼此协调作用的。2.51 过氧素研究发现，过氧素是一分子量为76KDa 的蛋白，它以非活化状态存在于成熟颗粒细胞与半颗粒细胞中，伴随着酚氧化酶原激活系统的激活而活化。过氧素是甲壳动物中发现的第一个黏附分子，它调节细胞间的连接，通过将外源物连到粒细胞表面特殊接收器上，使外源物成为更大的异物，包囊由此产生并被黑化。过氧素还具有过氧化物酶的功能和调理素的功能，同时它也是脱颗粒因子，能引起细胞的胞吐，经过这样的循环，proPO 被越来越多地从血细胞中排出。2.52 Masquerade-like 蛋白Masquerade-like 蛋白是一种与丝氨酸蛋白酶相似的异二聚

22、体蛋白，由分子量134KDa和129KDa两个单位组成，它不仅具有和酵母/细菌结合的结构域，还具有和血细胞结合的结构域，它随着proPO系统的激活自身发生水解。虽然尚不清楚其是否直接参与了proPO系统的激活，但它却具有调理素（opsonin）、细胞粘连蛋白（cell adhesion protein）和模式识别蛋白的作用。2.5.3 抗菌肽抗菌肽是一种具有抗菌活性的生物短肽，广泛存在于生物界中，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用，是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽经血细胞产生,并储存在血细胞中，在病原刺激下释放到血淋巴。酚氧化酶原激活系统中的SPs即能产生抗菌肽。在螯虾中，从

23、SPs前体的发夹区提取的重组肽(recombinant peptide)对革兰氏阳性菌有活性，它在SPs前体水解时被切下，其抗菌活性可能是伴随proPO活化而产生的。血蓝蛋白也能产生抗菌肽。血蓝蛋白经限制性蛋白水解产生虾红素1(astacidin1)，这个过程在proPO与-1,3-葡聚糖、LPS等接触时被触发，并由一种目前尚不清楚的半胱氨酸蛋白酶完成此酶切过程。3 酚氧化酶原激活系统的调节因为proPO系统所产生的醌和黑色素本身具有毒性，如果不加以限制，对甲壳动物自身来说也是非常不利的，因而对酚氧化酶原激活系统的活性调节机制也是人们研究的重要内容。其中主要的调节方式为对proPO 激活过程的调节和SPs 活性的调节。proPO 激活过程的调节方式在于SPs 是以非活性酶原的形式存在，只有在出现引发物的情况下，它才