第十四章液相色谱-质谱联用

1、114.3 液相色谱液相色谱-质谱联用分析法质谱联用分析法14.3 Hyphenated Technology of HPLC-MS液相色谱质谱联用（LCMS联用）2对于热稳定性差、不易汽化的样品，GSMS联用有一定的困难。因此，近年来又发展了液相色谱质谱联用技术。LC分离要使用大量的液态流动相，如何有效地除去流动相而不损失样品，是LCMS联用的难题之一。目前应用较多的有两种接口装置。LC-MS用传送带联接装置用传送带联接装置3 一一 、高效液相色谱、高效液相色谱- -质谱联用仪质谱联用仪 二、二、 离子源离子源 三、三、 质量分析器质量分析器 四、四、 串联四级质谱法的扫描方式和模式串联四级

2、质谱法的扫描方式和模式 五、检测器和真空泵五、检测器和真空泵 六、六、 LC-MSLC-MS分离条件的选择和优化分离条件的选择和优化 七、注意事项见建议七、注意事项见建议4一、液相色谱一、液相色谱- -质谱联用仪质谱联用仪1. 1. 液质联用仪组成流程液质联用仪组成流程5p 气相色谱-质谱联用（GC/MS）p 高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）；p 也可以质谱-质谱联用（MS-MS）。 基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当，加之使分离效果好的色谱成为质谱的进样器，而速度快、分离好、应用广的质谱仪作为色谱的鉴定器，使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器。一、液相色谱一、液相色谱- -

3、质谱联用仪质谱联用仪2. 2. 液质联用仪类型液质联用仪类型6p 气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。p 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图u 液质联用与气质联用的区别液质联用与气质联用的区别:7LC-MS联用仪系统构成8 广适性检测系统3. 3. 液质联用的优势液质联用的优势一、液相色谱一

4、、液相色谱- -质谱联用仪质谱联用仪9 分析热不稳定化合物 分析气相色谱-质谱无法分析的样品 分析大分子量的化合物，如生化样品 极高的灵敏度10 进一步增加 HPLC 的分离能力 114. LC-MS 4. LC-MS 联用中的转变过程联用中的转变过程 液相色谱的现实情况： 从高效液相色谱流出的化合物存在于大气压条件下的溶液之中 质谱的现实情况： 在高真空工作条件下的质谱仅接受气相的离子: : 因此，液质联用的接口接口必须完成: 带电状态: “中性 ”-离子 物态转变：液态 - 气态 真空变化: 760 torr 760 torr - 10 10-5-5 10 10-8-8 torrtorr

5、。p 从从LC-MSLC-MS转变转变 p LC-MSLC-MS转变过程转变过程 l 去除溶剂l 保留样品l 电离化合物12p 接口 13p API API接口：接口：Z-Spray Z-Spray 接口接口14二、离子源p 大气压电离大气压电离 (API) 技术技术 目前，LC-MS采用大气压离子化（Atmospheric pressure ionization, API)技术作为液质联用的接口技术，也是质谱离子化技术。p APIAPI主要包括：主要包括： 电喷雾 electrospray ionization, ESI 大气压化学电离 atmospheric pressure chemic

6、al ionization, APCIp 离子源：使样品产生离子的装置叫离子源。15（一）电喷雾离子源一）电喷雾离子源 ESIESI（二）大气压化学电离（二）大气压化学电离APCIAPCI（三）（三）ESIESI与与APCIAPCI比较比较二、离子源16电喷雾离子化ESI接口电喷雾离子化ESI特征电喷雾离子化ESI过程影响化合物 ESIESI电离的因素（一）（一） 电喷雾离子化电喷雾离子化 ESIESI171. ESI 1. ESI 接口接口（一）（一） 电喷雾离子源电喷雾离子源氮气用来做去溶剂气和锥孔气氩气做碰撞气先形成带点电荷先形成带点电荷18l 低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得

7、到一个质子)l 高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子l 几乎没有碎片离子l 可能生成加合物和/或多聚体;常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物l 灵敏度取决于化合物本身和基质（一）（一） 电喷雾离子源电喷雾离子源2. ESI 特征19u（1）形成带电小液滴u （2）溶剂蒸发和小液滴碎裂u （3）最终形成气相离子3. 电喷雾离子化电喷雾离子化ESIESI过程过程（一）（一） 电喷雾离子源电喷雾离子源20u（1 1）形成带点离子）形成带点离子3. 电喷雾离子化电喷雾离子化ESIESI过程过程2122u （2 2）溶剂蒸发和小液滴碎裂）溶剂蒸发

8、和小液滴碎裂3. 电喷雾离子化电喷雾离子化ESIESI过程过程23u（3 3）形成气相离子）形成气相离子对于半径对于半径 10nm10nm的液滴的液滴 , ,电荷的排斥作电荷的排斥作用导致离子从用导致离子从液滴表面蒸液滴表面蒸发而不是液滴发而不是液滴的分裂。离子的分裂。离子从溶液中转移从溶液中转移至气相至气相3. 电喷雾离子化电喷雾离子化ESIESI过程过程244. ESI-MS4. ESI-MS的基本离子化原理是：的基本离子化原理是： 溶剂由液相泵输送到ESI毛细管，经其内的不锈钢毛细管流出，在ESI高压电极处施以负的高电压, 小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷. 从而产生电化学反应：

9、通过溶剂组分氧化而去掉正离子或通过毛细管自身的氧化而增加负离子。在高温和氮气的吹扫下，溶剂逐渐挥发，变成小颗粒的液滴，由于高电场作用，极性溶质成为带电离子溶解在溶剂液滴上，当溶剂颗粒逐渐减小，小到一定程度，带电的溶质粒子便从液滴表面蒸发出来，形成带电离子，完成离子化25（4）影响化合物 ESIESI电离的因素l (a）化合物的浓度l (b）基质的性质l (c) 化合物的表面活性l (d) 流速26离子的释放取决于浓度. 信号在 10 M时达到饱和. 线性动态范围限制在2-3个数量级信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集,致使某些样品离子不能到达液滴表面.l ESI: 样品浓度对其响应的影响27

10、28l ESI:ESI: 基质对样品响应的影响基质对样品响应的影响 u 一般而言,样品信号强度响应随着其它电解质浓度的增高而降低;u 这一现象叫作离子抑制。u 样品离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致离子抑制。表面竞争表面竞争电荷竞争电荷竞争29p 基质选择一般原则基质选择一般原则 一般而言，对于正离子检测模式，样品必须比基质更具碱性，以便形成 (M+H)+ 或足够的极性去形成稳定的加和离子，例 (M+NH4)+。 对于负离子检测模式，样品必须比基质更具酸性，以便形成 (M-H)- 或足够的极性去形成稳定的加和离子，例如 (M+OAc)-。 l ESI:ESI: 基质对样品响应的影响

11、基质对样品响应的影响 30l ESI: ESI: 流速对样品响应的影响流速对样品响应的影响 ESI 响应随流速的增加而降低 对 ESI 接口来说,最佳工作流速为100-250 L/min.31大气压化学电离源 APCI接口大气压化学电离源APCI特征大气压化学电离源过程( (二）二） 大气压化学电离源大气压化学电离源 APCIAPCI32（二）（二） 大气压化学电离源大气压化学电离源 APCI 1. APCI 1. APCI接口接口雾化雾化332. 大气压化学电离源APCI特征 一般而言, 只生成单电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体; 一般是溶剂加合物及NH4+ (M+18

12、), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基质影响较小 (相对于 ESI)。质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响343. 大气化学电离过程大气压化学电离可分为以下两个步骤:l （1）快速蒸发l （2）气相化学电离(电晕放电)35l （1）快速蒸发 液流被强迫通过一根窄的管路以使其得到高的线速度 高温加热器和喷雾器使液流在脱离管路时蒸发成气体由于溶剂蒸汽的保护，样品分子较少受热裂解的影响，大量的热量用于溶剂的蒸发，但是有时也会有热不稳定样品分解36l （2）气相化学电离37Needle喷雾针喷雾针（Corona Needle电晕针电晕针reagent gas试剂气试剂气离子离子-

13、分子反应分子反应2. 大气压化学电离源大气压化学电离源 APCI38大气压化学电离源大气压化学电离源 APCI离子离子-分子反应分子反应质质 子子 转转 移移电电 子子 捕捕 获获电电 荷荷 交交 换换离离 子子 加加 和和适合于热稳定、易气化的小分子低极性化合物适合于热稳定、易气化的小分子低极性化合物39（三）（三）ESI与与APCI的比较的比较共同点都属于大气压电离法（都属于大气压电离法（APIAPI）通常产生通常产生 (M+H)+ 或或 (M-H)- 等准分子离子等准分子离子都使用高电压元件和雾化气喷雾法产生气相离子都使用高电压元件和雾化气喷雾法产生气相离子产生极少的碎片，但可以控制产生

14、结构碎片产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片40ESI与与APCI的比较的比较不同点生成离子方式不同生成离子方式不同样品兼容性不同样品兼容性不同流速兼容性不同流速兼容性不同ESI ：液相离子化：液相离子化APCI ：气相离子化：气相离子化ESI ：0.2-0.5ml/minAPCI ：0.5-1ml/minESI ：极性化合物和：极性化合物和 生物大分子生物大分子 APCI ：非极性：非极性, 小分子小分子化合物化合物 (相对于用相对于用 ESI电电离的化合物而言离的化合物而言) 且有一且有一定的挥发性定的挥发性4142 样品已经变成气相离子 样品仍处于大气压下 必须把样品送入质谱高真空环境

15、中43 蒸气通过样品锥孔进入一级真空区(离子源区)并且膨胀 蒸气在膨胀时会冷却 这种冷却可能导致在被分析物离子上的溶剂冻结从而生成各种质量数的簇离子一级真空一级真空成簇过程成簇过程簇离子会降低所要检测的被分析物质量处的信号；簇离子会增加背景信号44l 加热一级真空区 (离子源区) 以阻止簇离子的生成,使不带溶剂的样品离子被检测l 在通过加热的离子源区以后,样品离子在静电场作用下通过萃取锥孔l 通过萃取锥孔后, 样品离子进入六极杆聚焦透镜l 从六极杆聚焦透镜出来,样品离子进入四极杆质量分析器45三三. . 质量分析器质量分析器 双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector). 四极质谱仪(Q).

16、飞行时间质谱仪(TOF). 离子阱质谱仪（TRAP） 四极四极+TOF+TOF（Q-TOFQ-TOF） 串列式多级质谱仪串列式多级质谱仪三重四极（三重四极（QqQQqQ） (MS/MS) (MS/MS) TOF+TOF TOF+TOF1. 1. 分类分类46单四极杆分析器单四极杆分析器 QuadrupoleQuadrupole 由四根棒状电极组成由四根棒状电极组成直流电压：直流电压：DCDC射频电压：射频电压：RFRF形成二维四极电场形成二维四极电场离子在场的作用下产生振动，碰到四极杆而被吸收离子在场的作用下产生振动，碰到四极杆而被吸收通过四极杆的离子到达检测器被检测通过四极杆的离子到达检测器

17、被检测2. 2. 四级杆分析器四级杆分析器4748通过改变通过改变RF，从而改变通过的离子质量，从而改变通过的离子质量离子质量离子质量时时 间间扫描循环时间扫描循环时间扫描时间扫描时间回程回程时间时间程程序序处处理理时时间间49串联质量分析器串联质量分析器空间串联空间串联时间串联时间串联空间空间 - 时间串联时间串联四极杆串联四极杆串联 Q-Q-Q离子阱离子阱 FTICRQ-Trap都有碰撞活化室都有碰撞活化室50实验室现有的质量分析器类型：实验室现有的质量分析器类型：串联四极质谱仪(MS/MS) ： 三重四极（QqQ）离子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3

18、第一级质量分析器第一级质量分析器：用于选择一个前体离子或母离子，然后，用：用于选择一个前体离子或母离子，然后，用适当的活化方法是这一离子裂解成产物离子或称子离子及中性碎片。适当的活化方法是这一离子裂解成产物离子或称子离子及中性碎片。 mmp p+ + m mf f + +m+mn nmmp p+ + 为前体离子；为前体离子； mmf f+ + 为产物离子；为产物离子； mmn n为中性碎片为中性碎片； 第二级质量分析器第二级质量分析器：用于产物离子分析：用于产物离子分析如从产物中再选择一个离子，分析最后选择的离子的碎片，则标如从产物中再选择一个离子，分析最后选择的离子的碎片，则标记记MS/MS

19、/MSMS/MS/MS，数级可进一步增加至，数级可进一步增加至n n次，实现次，实现MSMSn n实验实验51串联质量分析器串联质量分析器三重四极杆三重四极杆三个四极杆串联三个四极杆串联 Q-Q-QQ1 质量分离质量分离Q2 碰撞活化碰撞活化 CIDCollision-Induced DissociationQ3 质量分离质量分离52 3. 碰撞诱导解离CID 质谱 QqQ 检测器中的碰撞反应在CID 中进行。选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(本实验室选择高纯氦) ，发生离子分子碰撞反应，从而产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱， 一般称做CID

20、 (collision-induced dissociation)谱。53CID CID 产生的过程产生的过程 544. 4. 影响影响CIDCID质谱的因素：质谱的因素：l 较大影响的因素有：所用碰撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的配置以及离子电荷状态l 由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。l 大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在E

21、I质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。55四、扫描方式和扫描模式四、扫描方式和扫描模式p 全扫描(Full Scan)p 子离子扫描(Daughter Scan)p 母离子扫描(Parent Scan)p 中性碎片丢失扫描(Constant Neutral Loss Scan)p 选择离子监测(SIR)p 多反应监测(MRM)（一）扫描方式（一）扫描方式（二）扫描模式（二）扫描模式p 正离子模式p 负离子模式561 1、全扫描、全扫描p 特征：特征：质谱扫描得到一段质量范围从而获得质谱图用于未知物的结构分析用于SIR方法的开发以及MRM方法开发寻找母离子最佳电

22、离参数Q3Q2Q1= scanned= CID= selected m/zl 定性定性 寻找总分子离子峰寻找总分子离子峰 出峰时间出峰时间 57p LC-MS LC-MS中常见的本底离子中常见的本底离子 m/z 50-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 离心管的

23、产生的特征离子 m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 m/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668 m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 58Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CIDp 过程：过程：通过Q1 选择目标物质的母离子，在Q2 发生碰撞反应，Q3 对目标物质丰度最大的子离子进行扫描。2 2、子离子扫描、子离子扫描p 特征：特征：监测单个离子或一系列单个离子目标化合物的跟踪提高采

24、集灵敏度10023059p 子离子质谱图子离子质谱图用MS2MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离经碰撞产生。60p 子离子扫描质谱图61用MS1MS1质量分析器扫描能丢失指定质谱碎片的母离子，所得到的母离子质谱峰一定是能丢失指定质谱碎片的母离子。p 母离子质谱图 3 3、母离子扫描、母离子扫描62p母离子扫描质谱图母离子扫描质谱图634 4、中性碎片丢失、中性碎片丢失母离子扫描、中性丢失扫描可用来研究结构相似性化合物（如具有相同结构碎片、或相同结构基团的化合物）Q3Q2Q1= scanned= CID= scanned with offset64p 中性碎

25、片丢失扫描质谱图MS1MS1质量分析器扫描能丢失指定中性碎片的母离子，MS2MS2质量分析器扫描丢失指定中性碎片的离子，所得到的质谱图是由MS1MS1扫描的母离子，母离子只能是丢失指定中性碎片的离子65p 中性碎片丢失扫描质谱图665. 选择离子扫描Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CID定 量 满足一般要求 信噪比不如MRM只监测指定的离子67p 选择离子记录(SIR)MS1MS1质量分析器是静态，并且只监测指定的离子。68p 选择离子记录扫描 696.多反应监测多反应监测 SRM & MRMSRM & MRMp 特征：特征：监测特定母离子产生特定

26、子离子碎片的化合物目标化合物的跟踪提高采集灵敏度，是灵敏度最高的定量采集方式定定 量量 最佳选择最佳选择 干扰小干扰小 信噪比高信噪比高Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CID70p 子离子质谱图子离子质谱图指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的。71p 多反应监测扫描72串联质量分析器串联质量分析器三重四极杆三重四极杆73化合物鉴别化合物鉴别 全扫描方式（全扫描方式（Q1Q1扫描）扫描） 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。 子离子分析（

27、子离子分析（ MS/MS MS/MS ） 子离子，用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。 子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。74（二）扫描模式一般的商品仪器中,ESI 和APCI 接口都有正负离子测定模式可供选择。一般不要选择两种模式同时进行。正、负离子模式建议根据文献选择。75正离子模式：正离子模式： 适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考

28、虑使用正离子模式。2. 2. 负离子模式：负离子模式： 适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。（二）扫描模式选择的一般原则为选择的一般原则为76检检测测器器数数据据分分析析电电 子子 倍倍 增增 管管光光 电电 倍倍 增增 管管电电 子子 倍倍 增增 管管打打 拿拿 极极PCQ3五、检测器和真空泵五、检测器和真空泵77高真空泵高真空泵 10-6Torr油扩散泵油扩散泵涡轮分子泵涡轮分子泵极限真空可达极限真空可达10-5 -10-6Torr蒸汽喷射泵蒸汽喷射泵泵液蒸汽返流，提高本泵液蒸汽返流，提高本底、易污染系统

29、底、易污染系统五、检测器和真空泵五、检测器和真空泵78高真空泵高真空泵 10-6Torr油扩散泵油扩散泵涡轮分子泵涡轮分子泵真空可达真空可达10-5 10-6Torr小型蒸汽涡轮机小型蒸汽涡轮机高速旋转叶片高速旋转叶片贵、易损贵、易损79真空系统其他附件真空系统其他附件真空规（真空计）真空规（真空计）真真 空空 管管 道道真真 空空 阀阀 门门吸吸 附附 阱阱抽抽 气气 方方 式式单泵抽气方式单泵抽气方式双泵差动抽气方式双泵差动抽气方式801. 1. 样品的预处理样品的预处理：u从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。u要求获得最

30、佳的分析结果，从ESI电离的过程分析：ESI电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。六、六、 LC-MSLC-MS分离条件的选择和优化分离条件的选择和优化p分离条件选择分离条件选择81样品的预处理常用方法样品的预处理常用方法 a）超滤 b）溶剂萃取去盐 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）净化去盐 e）色谱分离 反相色谱分离 亲和技术分离 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化822. 2. 电离源的选择电离源的选择 ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特

31、别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）。只要有相对强的极性，ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果。 APCI不适合多电荷的大分子分析，它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析。83电离方式电离方式 ESI采用离子蒸发方式使样品分子电离，而APCI电离是放电探针促使溶剂和其它反应物电离、碰撞及电荷转移等方式形成了反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生了质子转移。样品流速样品流速 APCI源允许的流量相对较大，0.2-2mL/min，而ESI源允许流量相对较小，最大只能为1.0mL/min。断裂程度断裂程度 APCI源的探头处于高温，可使热不稳定的

32、化合物分解，产生碎片；ESI源探头处于常温，常生成分子离子峰，不易产生碎片。灵敏度灵敏度 都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性小的化合物。多电荷多电荷 APCI源不能生成一系列多电荷离子，所以不适合分析生物大分子。而ESI源特别适合于蛋白质、多肽类的生物分子，由于它能产生一系列的多电荷离子。843. 3. 正负离子模式的选择正负离子模式的选择l 正离子模式适合于碱性样品，可用乙酸（pH3-4）或甲酸（pH2-3）对样品加以酸化。l 负离子模式适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。l 有些酸碱性并不明确的化合物，可优先选用APCI（+）进

33、行测定。854. 4. 流动相的选择流动相的选择u 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。u LCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5 mmol/l。u 送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。86 不适合的溶剂和缓冲液不适合的溶剂和缓冲液a 不挥发的盐b 表面活性剂/洗涤剂c 无机酸 其它溶剂和

34、调节剂其它溶剂和调节剂a 异丙醇、2-甲氧基乙醇及乙醇等b 三氟醋酸（TFA）常用于LC-MS分析肽和蛋白质的化合物c 三乙胺（TEA） d 四氢呋喃（THF)875. 5. 流量和色谱柱的选择流量和色谱柱的选择u不加热ESI的最佳流速是150ulmin，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱uAPCI的最佳流速lmlmin，常规的直径4.6mm柱最合适。u为了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。886. 6

35、. 辅助气体流量和温度的选择辅助气体流量和温度的选择u 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。u操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。u选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。89用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息 正离子方式常出现如下离子: -Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher tha

36、n M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. higher than M+H 2M+H,2M+Na等 负离子方式常出现如下离子: -TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher then M-H -Formic 46 Da. higher then M-H -Cl 36 Da. higher than M-H 90影响分子量测定的因素 1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些

37、，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形。 2）气流和温度：当水含量高及流量大时要相应增加。 3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。 4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些 5）选择合适的液相色谱类型：正相、反相、选择合适的色谱柱 6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时回使多电荷离子比例低，多聚体也减少 7）样品结构和性质 8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好 9）样品浓度不够，有时需要浓缩91分子量测定失败的原因 a）流动相不合适 b）不挥发性盐的影响 c）成

38、分复杂，杂质太多 d) 样品浓度不够 e）pH值不合适 f）样品在源内分解或碎裂92一一般般步步骤骤确定离子源、正负模式确定离子源、正负模式优化流动相、离子源参数，使优化流动相、离子源参数，使Q1信号最大化信号最大化打开打开Q2、Q3，优化，优化CID，确定子离子，确定子离子优化优化Detector、Scan time等等参数等等参数p 分离参数优化分离参数优化93分分析析待待测测物物性性质质极极 性性极性、弱极性极性、弱极性 ：ESI非极性非极性：APCI热稳定性热稳定性热不稳定热不稳定 ：ESI热稳定热稳定：APCI分分 子子 量量310LC-MS/MS 2000特殊性质特殊性质正正/负模

39、式负模式表面活性剂？污染？表面活性剂？污染？影影 响响 定定 性性 结结 果果94仪仪器器参参数数的的设设置置雾化针电压雾化针电压雾化气流量雾化气流量流动相比例、流速流动相比例、流速色谱柱色谱柱干燥气温度干燥气温度干燥气流量干燥气流量毛细管电压毛细管电压碰撞活化能量碰撞活化能量检测器电压检测器电压扫描时间扫描时间质谱峰宽质谱峰宽离子源腔室温度离子源腔室温度总总 结结95磺磺胺胺吡吡啶啶ESIScan（+）200-300m/zScan（-）200-300m/z确定离子源、正负模式确定离子源、正负模式S/N = 1096SIM（+）（）（m/z=250.0）SIM（-）（）（m/z=247.5）S/N = 110097优化离子源参数，使优化离子源参数，使Q1信号最大化信号最大化干燥气温