甲胎蛋白基因的转录水平检测

1、甲胎蛋白基因转录水平的检测一实验目的二实验方法及原理三技术路线四结果分析五应用通过提取肝癌病人的癌细胞组织和癌旁组织，根据mRNA丰度的测定方法，从转录转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测肝癌病人术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80冻存。取材目的 通过细胞RNA的提取提取技术，将定量的组织中的RNA提取出来，然后使用Northern blot技术，通过琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳、原位转移原位转移、放射自放射自显影显影，测定AFP mRNA的丰度。Northern blot: （诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。首先通过电泳的方法将

2、不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段原理细胞RNA的提取RNA的分离纯化4.RNA转移和固定琼脂糖凝胶电泳分离RNA探针分子杂交放射自显影 TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol法u匀浆处理:将组织在液氮中磨碎 ,100mg组织中加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。u室温（15-30）放置5分钟。u加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。u2-810000g离心15分钟。u把水相转移到新管中。用0

3、.5ml异丙醇沉淀水相中的RNA。室温放置10分钟。u6.2-810000g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，收集沉淀。u7.用70乙醇洗涤RNA沉淀。至少加1ml 70乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟，弃上清。u8.得到RNA。RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。纯化要求1、凝胶准备、凝胶准备：用0.5TBE配制2琼脂糖凝胶。 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5TBE； 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入EB 0

4、.5g/ml，并轻轻混匀。2、胶床准备：、胶床准备：取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约58mm的挡墙。将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。将胶床放在调整好的水平台上。铺胶铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度35mm。室温下静置室温下静置1小时左右，凝胶固化小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶 床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液电泳缓冲液，以越过凝胶表面12mm为宜。轻轻拔出固定在凝胶中的梳子轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处 (样品孔) 即被

5、缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。样品准备样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。上样上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般1030l。盖上电泳槽，接通电源，开始电泳盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压15v/cm；时间1小时左右。电泳结束后，切断电源，取出凝胶电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析紫外灯下观察RNA。测量从加样孔到各条带的距离。一RNA片段大小的对数值对迁移的距离作用，用得到的曲线课计算点杂交检测到的RNA大小Northern印迹又称RNA印渍术，是将

6、存在于凝胶中的RNA分子转移（印渍）于固定化介质(如：硝基纤维素膜)上并加以检测分析的技术，可以用合成的寡核苷酸片段作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记，特点专一性好，假阳性率低，用于RNA水平分析等。u取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。u室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。u室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。u20SSC洗胶1h。u20SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。u取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2h。基因探针基因探针，即核酸探针，是一段带有

7、检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。（将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针）根据美国PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针序列如下：5（FAM）TACTGCAGAGATAAGTTT3（TAMRA）探针是由上海基康生物工程公司合成。来自网络资料参考放射自显影：放射自显影：是一种利用放射性核素发射的核射线，使乳胶中的卤化银感光形成潜影，经显影和定影，形成图像。借助感光银颗粒所在部位和强度，能准确判断放射性示踪剂的分布部位和数量。1、凝胶准备、凝胶准备：用0.5TBE配制2琼脂糖凝胶。 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml

8、0.5TBE； 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入EB 0.5g/ml，并轻轻混匀。2、胶床准备：、胶床准备：取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约58mm的挡墙。将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。将胶床放在调整好的水平台上。铺胶铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度35mm。室温下静置室温下静置1小时左右，凝胶固化小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶 床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液电泳缓冲液，以越过凝胶表面12mm为宜。轻轻拔出固定在凝胶中的梳子轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。样品准备样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。