蛋白质的纯化课件123

1、1梁贾春子 汪淳 管家伟 梁玉莲 关丹丹蛋白质工程2世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮 -冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory）3蛋白质工程中进行蛋白质分离纯化的必要性化学修饰法对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白质作为原材料为了研究蛋白质工程的效果，需要单一的蛋白质作为实验材料研究其结构与功能为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相关产品4一、蛋白纯化方法能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化性质上有着极大的不同。这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目和序列不同造成的。51.与

2、蛋白质分离纯化相关的理化特性分子大小分子形状带电特性溶解特性与配体特异性结合不同吸附性质变性和复性61.1分子大小大小蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。几百百万 Da常用方法透析超滤凝胶过滤离心7原理：透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。8超速离心91.2分子形状形状形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到它的形状的影响。方法梯度离心的影响电泳的影响101.3电荷原理蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势，

3、在pH 7.0时带净负电荷，称为酸性蛋白质。若赖氨酸和精氨酸占优势，在pH 7.0时带净正电荷，称为碱性蛋白质。方法电泳离子交换层析111.4溶解度原理由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂中的溶解度不同。方法：通过改变pH、离子强度或加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法121.5配体特异性结合原理生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合，这种结合是特异的又是可逆的，生物分子间的这种结合能力称为亲和力。方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。分

4、类免疫亲和层析生物亲和层析金属螯合亲和层析拟生物亲和层析131.6变性和复性原理蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。方法尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白142. 分离方法沉淀法离心法电泳法超滤法相分配法层析法1516不可能有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，但每一种蛋白质可能都有一套适合的分离纯化程序，而且所用的主要技术手段都基本相同。17二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留

5、其生物学活性和化学完整性。步骤选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定 18蛋白质纯化的前期准备 什么是最好的来源：蛋白质需要有多纯：纯化蛋白的量要多少：蛋白质应该如何进行鉴定：纯化时间应该多长:什么是最终花费：如何纯化蛋白质：关于蛋白质我们已知什么： 193、蛋白质的粗分级使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。204、蛋白质的细分级粗分级只是使蛋

6、白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。常用的实验技术：层析和电泳214.1. 层析（ chromatography ）分子筛层析（ Gel filtration ）离子交换层析（ Ion exchange ）疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ）亲和层析（ Affinity ）羟基磷灰石层析224.1.1 分子筛层析Gel filtration chromatography原理分子筛层析, 也称为凝胶过滤、分子排阻层析。是以多孔性凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，

7、分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。凝胶介质葡聚糖 （glucose）琼脂糖 （agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）234.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）原理蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层析方法。种类阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷介质惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖带电基团：羧甲基带负电 二

8、乙基氨基带正电平衡离子：负电基团的平衡离子氢或钠离子 正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子244.1.3 亲和层析（Affinity chromatography）原理亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白，然后改变洗脱条件，将目标蛋白洗脱下来。254.1.4疏水作用层析原理蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可逆相互作用，高浓度的盐会增强相互作用，低浓度的盐会减弱相互作用。方法高离子强度下待分离的样品吸附

9、在疏水介质上，然后降低离子强度选择性将样品解吸，疏水弱的物质先洗脱，疏水强的物质后洗脱。264.2.电泳（ Electrophoresis ）电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极电泳就是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动。移动。27蛋白质常用电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）双向电泳（双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）28Two Dimensional

10、Electrophoresis of E. coli Proteins - more than 2,000 proteins were visualized29三、蛋白纯化原则Guidelines for Protein Purification确定目标确定目标purity, activity and quantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性to simplify technique selection and optimisation确定活性测定方法确定活性测定方法fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤尽量减少纯化步