现代食品微生物学复习整理上海海洋大学硕士课程宁喜斌

1、原核微生物：原核生物是由原核细胞组成的生物，具有细胞结构但是无核膜包着的细胞核包括蓝细菌、细菌、放线菌、立克次氏体、支原体和衣原体等。微生物的分离与纯化：从自然界或混有杂菌的培养体中将所需要的微生物提纯出来。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化单细胞挑取法：采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。培养基：是供微生物、植物和动物组织生长和维持

2、用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等选择培养分离：通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离富集培养分离：创造特定的环境条件（温度、PH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等），使仅适应于该条件的微生物生长旺盛，从而使其在群落中的数量大大增加。再通过稀释平板法分离纯化。生长曲线：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样，测菌量。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。代时G：单个细胞完成一次分裂所需要的时间，G=t/n=(t1-t0)/3.3(logx-logx0)产

3、量常数：表示微生物对基质利用效率的高低，Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度，根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量。恒浊培养：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。恒化培养：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。连续培养：向发酵罐或培养罐中不断通入营养物质，同时不断提取产物的生产方式，可不用多次接种，连续的获得培养产物固定化细胞连续培养：细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法同步生长：运用同步培养技术，控制微生物生

4、长，使之处于同一生长阶段并同时分裂。高密度培养：指微生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术主要是用于基因工程菌生产多肽类药物。灭菌：采用任何强烈理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失生长繁殖能力的措施杀菌：菌体虽死，形体尚存溶菌：菌体被杀死以后，细胞自溶、裂解而消失消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分的病原菌，而对被消毒的对象基本无害防腐：采用某种理化因素完全抑制微生物的生长繁殖（制菌作用）化学治疗：指具有高度选择力（对病原菌具高度选择力而对其宿主基本无毒）的化学物质来抑制宿主体内的病原微生物的生长繁殖，达到治疗宿主疾

5、病的目的的一种措施。表型：基因突变形成新的基因型在一定环境条件下表现出来的个体性状。突变体：突变产生新表型的个体。基因突变：指DNA特定部位上核苷酸顺序的变化，致使蛋白质的结构改变，最后导致个体表型不同。无义突变：是编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后，变成不编码任何氨基酸的终止密码。虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误，但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位，就使翻译时多肽链的终止就此终止，形成一条不完整的多肽链。同义突变: DNA复制时，DNA链中某个碱基被另外一个碱基替代，但是不会影响到其所翻译的蛋白质的结构和功能。错义突变: 是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种

6、氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。移码突变: 在基因编码区，核苷酸插入或缺失导致三联体密码子阅读方式的改变，从而使该基因的相应编码序列发生改变。条件致死突变型：在野生型生物可生育或增殖的条件下，而不能生育或增殖的突变型，即需要特定的营养物质的营养缺陷型以外的突变型，称为条件致死突变型。诱变：采用某些诱变剂以人工方法引起遗传物质结构改变，使其产生人类所需要的产品。诱变剂：能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂微生物细胞包埋法：包埋法是利用线性或者网状结构的高分子聚合物夹裹作用，将微生物截留在形成的高分子材料内，微生物自身并不参加凝胶基体发生化学键合

7、作用工业用微生物的基本要求：菌株为“纯培养”菌种具有稳定的遗传性菌株生长迅速产生目的产物时间短尽可能自我保护产物单一，易于分离常用的分离培养基：细菌：肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏号培养基；真菌：马铃薯培养基、马丁氏培养基、查氏培养基；酵母：麦芽汁培养基采样时要注意的问题：气候、水分、空气；来源要广；结合产品的特点；标签：地点、时间、气候等一般微生物分离：方法：平皿划线分离法、倾注平皿稀释分离法、涂布平板法、液体分离法、厌氧菌的稀释分离法、单细胞挑取法。步骤：采集菌样；富集培养；纯种分离；性能测定平皿划线分离法步骤：在火焰上灼烧灭菌接种；挑取待分离样品C1、C2、C3、C4分别为第1、2、3、

8、4次平板上划线；培养结果倾注平皿稀释分离法操作步骤：系列稀释；倾注平板；分离获得的单个菌落用于筛选的几种特异技术：纸条测定法纸条与平板结合测定法表面培养法：优点：操作简便，设备简单，常用于实验室小规模培养。缺点：用于大规模生产的潜力很小；不便于对体系进行监测控制；不易于保持系统内环境条件的均一。例：实验室进行表面培养常采用试管、扁瓶和培养皿。浅盘培养迟缓期：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。原因：由于细胞进入新环境细胞数目无增长，甚至有所下降有一个适应过程，进行大量的酶（诱导酶）的生成。细胞特点：细胞的新陈代谢非常旺盛，个体体积显著增大，为细胞分裂作准备。此期长短：与菌种遗传特性、菌龄、接种

9、量、培养条件有关。意义：在实际工作中，缩短lag phase的措施：加大接种量（群体优势-适应性增强）先用对数其的种子（此时细胞分裂旺盛）调整培养基的成分，使种子基含有发酵培养基的成分选用繁殖快的菌种对数期：现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。细胞特点：此时细胞的大小、组成、生理特征等均趋于一致，代谢活跃，生长速率高，代时稳定。代时（世代时间Generation time, G）：单个细胞完成一次分裂所需要的时间, G=t/n=(t1-t0)/3.3(logx-logx0)。与菌种有关；受培养条件(温度、营养成分）的制约；同一菌种在不同培养条件下代时不同。意义：代谢、生理研究

10、的好材料；生产中用其作种。稳定期：现象：活菌数目不增不减，生长速率趋于0，曲线有一下降的趋势。特点：细胞的菌体形态典型，芽孢形成，细胞内开始贮藏物质。出现原因：营养物质大量消耗；有毒代谢产物大量积累；外界条件影响（pH、高细胞浓度，氧化还原电位等）。意义：发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料）、调pH、调整温度稳定期细胞数目及产物积累达到最高。产量常数：概念：表示微生物对基质利用效率的高低，Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度，根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量。衰亡期：现象：细胞死亡速率生长速率。一般总菌数不变，活菌数曲

11、线下降。特点：菌体变形，大小不一，细胞出现自溶，生理代谢活动停滞。恒浊培养：概念：在恒浊器内，调节培养基流速，使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：维持菌浓度不变。特点：基质过量，菌以最高速率。生长：但工艺复杂，烦琐。恒化培养：概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：恒化器中动态平衡的稳定性，是以某种生长限制因子（如碳、氮源；生长因子；无机盐等）的浓度来控制菌的生长速度。特点：维持营养成分的低浓度，控制微生物生长速率。连续培养：优点：缩短发酵周期，提高设备的利用率；便于自控。降低动力消耗及劳动强度；产品均一；主要问题：随着操作时间的增加，染菌的机率增大。如

12、提高培养温度、改变pH或原料等，可使杂菌不易生长。连续培养的另一个问题是在长期的培养中，菌种发生变异，引起生产能力下降。固定化细胞连续培养：细胞固定化是通过包埋法、微胶囊法、吸附法等将细胞固定在载体的内部或表面，加入营养液及合适的培养条件，得到代谢产物。优点：可提供高密度的细胞；减少细胞的流失，反复利用；简化细胞与代谢产物的分离工艺。缺点：成本高；易污染；物质传递阻力大；只能用于细胞分泌型产物的发酵。获得同步生长的方法：机械法：收集同样大小的细胞。密度梯度离心，选择性滤膜法。调整生理条件法：温度、光、限制因子等。例：温度开始很低，使其均处在仅活着的状态升高温度同步生长。抑制DNA长法：加入代谢

13、抑制剂，阻遏DNA复制解阻遏同步中间补料培养：有利于消除或减少因易被利用基质（如葡萄糖）引起的抑制作用的影响。使培养过程中的需氧量能适应培养设备的供氧能力。避免培养基中的有毒组分（如青霉素发酵中作为前体的苯乙酸）对培养的影响。中间补料可为实现高密度培养创造条件。防腐方法及其在食品工业中的应用：低温：4摄氏度以下；缺氧：抽真空、充氮或二氧化碳、除氧剂；干燥：晒干、烘干或红外线干燥；高渗：盐腌；高酸度：泡菜发酵；高醇度；防腐剂：苯甲酸、对羟基甲酸甲脂等几种常用的理化灭菌方法：干热灭菌法：火焰烧灼法、烘箱内热空气灭菌法；湿热灭菌/消毒法：常压法（巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法）、加压法（常规加压

14、蒸汽灭菌法、连续加压蒸汽灭菌法）；过滤除菌法；紫外线灭菌法；化学药剂消毒灭菌干热灭菌机理：细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥。利用温度杀菌的定量指标：热死时间，热死温度影响蒸汽加压灭菌效果的因素：灭菌物体含菌量；灭菌锅内空气排除程度；灭菌对象的pH；灭菌对象的体积；加热与散热速度高温对培养基成分的有害影响：沉淀：有机物（多肽类）、无机物（磷酸盐、碳酸盐）；营养破坏：Maillard反应、毒性；pH值改变；培养基浓度降低。防止法：特殊加热灭菌法：分别单独灭菌、低压灭菌；过滤除菌法：各种滤器，缺点：无法去除病毒；其他方法突变型的种类：形态突变型；生化突变型；条件致死突变型；致死突变型；抗性突变型抗

15、性突变体产生原因：突变；质粒；生理适应自发突变的原因：环境因素：宇宙间的紫外线、短波辐射、高温、病毒等；碱基错配；代谢产物的作用：过氧化氢、硫氰化合物、咖啡碱等。影响菌种生长发育的主要因素：培养基；培养基斜面制备技术；移种的密度；温度；湿度；药品的原材料质量紫外线诱变育种的操作过程：菌种的转移-菌液的制备-紫外照射-菌液稀释-培养-稀释-计算出发菌株注意事项：选择具备一定生产能力或某种特性的菌株；选择纯种（单倍体、单核、少核）；应考虑其稳定性；连续诱变育种过程中如何选择出发菌株（应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株）产品质量指标：全部食物中可检测存在的微生物，并可通过检测的微生物评价食

16、物的质量（或缺陷）；微生物的生长和数量应与产品质量有一种直接的互为对立的关系；易于检测和计数并可从其他微生物中明确区分开所要检测的微生物；在短时间内最好在一个工作日内可以计数；微生物生长不应受食品微生物群落中其他成分的负面影响食品安全性指标应满足的条件：易于快速检测；易于从其他食品微生物中区分开来；有可检测到的致病菌的相关阶段；与相关致病菌同时存在；是一种其数量应与相关致病菌有关的微生物；具有与致病菌等同的生长要求和生长速率；具有类似于致病菌的死亡率，并且最好比相关致病菌更加稳定；除了可能含有的某一最小数量外，在对于致病菌开放的食物中数量较少大肠杆菌作为粪便污染指标：所选择的细菌理想上应具有专

17、一性，只在内部环境中出现；它们在粪便中应有很大数量从而需进行高倍稀释；它们对于外部环境应有较高的耐受性，从而可以评价它们对外界环境的污染；当它们数量较少时，应可以进行相对容易和可靠的检测用作水污染指标的典型肠球菌：它们通常在水中不增殖，特别是在有机物含量低的时候；在人类粪便中数量通常少于大肠杆菌，粪便大肠菌群的数量达到肠球菌的4倍或更高，则意味着受到人类排泄物的污染。因此，典型肠球菌试验比粪便大肠菌群更能反映肠内致病菌的数量；在水中肠球菌的死亡率比大肠菌群低，因此它们的寿命通常比致病菌长几种主要的致病菌：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、弧菌微生物的重要性：自然界中微生物的主要功能是自我生

18、存；微生物参与地球生物循环，其中最重要的是氮循环；研究与自然界中动植物食品相关的微生物类型，有助于预测食品中可能存在的微生物类型，以及其数量消长情况；微生物引起食物腐败，是其在自然界中的主要功能之一。食品中微生物的主要来源：土壤和水：土壤和水体中的微生物相似或相同，但某些水体中的微生物不能进入土壤，特别是海洋微生物，海洋中的细菌主要是革兰氏阴性菌；植物和植物产品：那些能够附着在职务表面，不易被洗去，能够获得所需的营养，主要是乳酸菌和一些酵母，其他如棒杆菌、短小杆菌、假单胞菌、黄单胞菌等；食品器皿、用具：如在一个容器中放入的蔬菜较多时，会形成一定数量的微生物群落；人与动物的肠道：当使用污染的水冲

19、洗食品原料时，肠道微生物就变成水源微生物，肠道微生物菌群去多不能在水中长期存留，如沙门氏菌；食品生产者：手、外套、鼻孔、口腔、皮肤；动物饲料：动物饲料一直是家禽和其他动物的沙门氏菌主要来源，某些青贮饲料是乳品和肉禽单增李斯特氏菌的主要来源，干饲料中的微生物可在环境中扩散，存留在动物的皮毛中；畜皮：鲜乳中的微生物类型反映出奶牛乳房上以及动物生存环境中的微生物群落；空气和尘埃：可以存留在空气中的微生物包括革兰氏阳性菌，以及去多霉菌和一些酵母。食品中影响微生物生长的内在因素：pH；含水量；氧化还原电位；营养成分：水分、能源、氮源、维生素及相关的生长因子、矿物质；抗微生物成分：丁香酚、大蒜素、肉桂醛、

20、芥子油、乳铁蛋白、溶菌酶；生物结构：种皮、果皮、果壳、皮毛、蛋壳食品中影响微生物生长的外在因素：贮藏的温度；环境的相对湿度；环境中的气体及其浓度；其他微生物及其活性：抗生素、细菌素、过氧化氢、有机酸食物氧化还原电位由以下因素决定：原食物的特征性氧化还原能力；平衡能力，即食物中抗电势变化能力；食物周围环境氧的压力；食物接触空气的途径。微生物细胞包埋法：优点：稳定性强；操作条件温和；对外界环境缓冲作用大；易于在生；产物分离提取容易；较好的保存了其内多酶系统的活力；可以像游离细胞一样进行发酵生产。缺点；营养物质产物扩散受到限制用于好氧微生物研究有限制；菌体在凝聚表面的生长及菌体的渗漏都影响固定微生物

21、的作用；常用的包埋材料价格高；有些材料有毒环境中的气体及其浓度：CO2是一直食物中微生物生长的最重要的气体。微生物暴露CO210%时：CO2的一直作用随温度的降低而增加；2030%浓度最佳，20%浓度的CO2特别适合新鲜肉贮藏，而高浓度常用于贮藏海鲜食品；当PH降低到酸性范围抑制作用增强；对革兰氏阴性菌效果较好；对数期延缓；加压比常压具有更好的抑菌效果，如当压力630MPa的变化过程中可以杀灭细菌和真菌，这种作用发生在压力突然释放时。原生质体技术：优点：去除了细胞壁的障碍；原生质体融合后，二亲株的基因组之间有机会发生多次交换；融合重组的频率高；融合技术可以和其它的育种方法相结合。步骤：遗传标记亲株筛选；原生质体制备；原生质体再生及再生频率计算；原生质体融合；异核体