实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定

1、1实验三实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定牛乳中酪蛋白的制备与鉴定 温馨提示：请将教室水浴锅打开，温度调至温馨提示：请将教室水浴锅打开，温度调至40。并将乙酸。并将乙酸-乙酸钠缓冲液（乙酸钠缓冲液（1瓶瓶/室）放入水室）放入水浴锅内，预热至浴锅内，预热至40。2（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。）学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。（2）了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。）了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。（3）验证蛋白质的双缩脲反应性质。）验证蛋白质的双缩脲反应性质。（4）学习和掌握蛋白质双缩脲反应的原理和方法。）学习和掌握蛋白质双缩脲反应的原理和方法。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 牛

2、乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为点为4.8。利用。利用等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低的原理，将牛的原理，将牛乳的乳的pH调至调至4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗乙醇洗涤沉淀物涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质乙醚除去脂类杂质后便可得到纯的酪后便可得到纯的酪蛋白。蛋白。二、实验原理二、实验原理 两分子尿素加热到两分子尿素加热到180左右时，生成双缩脲左右时，生成双缩脲并放出一分子氮，并放出一分子氮，双缩脲双缩脲在在碱性环境碱性环境中能与中能与Cu

3、2+结合生成结合生成紫红色化合物紫红色化合物，此反应称为，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应。 二、实验原理二、实验原理 蛋白质分子中有蛋白质分子中有肽键肽键，其结构与双缩脲相似，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应，因此该反应可用于蛋白质的也能发生此反应，因此该反应可用于蛋白质的定定性性或或定量定量测定。测定。N N 端端C C 端端6三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、仪器、仪器： 恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、酒精灯等。恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、酒精灯等。2、试剂、试剂： 乙酸乙酸-乙酸钠缓冲液（乙酸钠缓冲液（pH4.6）、1%氢氧化钠、氢氧化钠、10%乙酸、蒸馏水、无水乙醇、乙酸、蒸

4、馏水、无水乙醇、10%氯化钠、氯化钠、0.5%碳碳酸钠、酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、氢氧化钠、0.2%盐酸、饱和氢氧化钙、盐酸、饱和氢氧化钙、尿素尿素、10%氢氧化钠、氢氧化钠、1%硫酸铜。硫酸铜。7四、实验步骤四、实验步骤1 1、酪蛋白的制备：、酪蛋白的制备： （1）量取）量取10mL牛奶置于牛奶置于25mL刻度试管中，水浴中加刻度试管中，水浴中加热至热至40。在搅拌下慢慢加入。在搅拌下慢慢加入10mL预热至预热至40的的乙酸乙酸-乙乙酸钠缓冲液（酸钠缓冲液（pH4.6）。用精密试纸调用精密试纸调pH值至值至4.8（可选择（可选择1%氢氧化钠氢氧化钠或或10%乙酸乙酸溶液进行调整）。溶液

5、进行调整）。40保温保温10min，使沉淀完全。使沉淀完全。 （2）将上述悬浮液冷却至室温。）将上述悬浮液冷却至室温。2000r/min离心离心5min，弃去上清液。弃去上清液。8四、实验步骤四、实验步骤1 1、酪蛋白的制备：、酪蛋白的制备： （3）往沉淀物中加入）往沉淀物中加入5mL蒸馏水，混匀后蒸馏水，混匀后2000r/min离心离心5min， 弃去上清液。弃去上清液。 （4）将洗净的沉淀物加入）将洗净的沉淀物加入3mL无水乙醇，混匀后无水乙醇，混匀后2000r/min离心离心5min， 弃去上清液，得弃去上清液，得酪蛋白粗制品。酪蛋白粗制品。 （5）将沉淀物全部摊开在）将沉淀物全部摊开在

6、已称过重的滤纸已称过重的滤纸上，置于上，置于25烘箱中烘干。烘箱中烘干。 （6）准确称重，计算牛乳中酪蛋白含量（）准确称重，计算牛乳中酪蛋白含量（g/100mL）,并与理论含量为并与理论含量为3.5g/100mL牛乳相比较，求出实际得率。牛乳相比较，求出实际得率。9四、实验步骤四、实验步骤2 2、酪蛋白的溶解度鉴定：、酪蛋白的溶解度鉴定： 取取6支试管，分别加入蒸馏水、支试管，分别加入蒸馏水、10%氯化钠、氯化钠、0.5%碳碳酸钠、酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙各盐酸及饱和氢氧化钙各1mL。于每管中加入少量酪蛋白，不断摇荡，观察并记录。于每管中加入少量酪蛋

7、白，不断摇荡，观察并记录各管中酪蛋白的溶解度。各管中酪蛋白的溶解度。10四、实验步骤四、实验步骤3 3、酪蛋白的颜色反应（双缩脲反应）：、酪蛋白的颜色反应（双缩脲反应）： 取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔取少量尿素结晶，放入干燥的试管，微火加热使尿素熔化，熔化的尿素开始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双化，熔化的尿素开始硬化时停止加热，尿素放出氮，形成双缩脲。冷却后，加入缩脲。冷却后，加入1mL 10NaOH溶液，振荡混匀，再加溶液，振荡混匀，再加入数滴入数滴 1CuSO4溶液，振荡，观察实验现象。（溶液，振荡，观察实验现象。（此步骤由此步骤由教师演示。）教师演示。） 向另一支

8、试管中加入少量酪蛋白溶液，加入向另一支试管中加入少量酪蛋白溶液，加入2mL 10NaOH溶液，摇匀，再加入数滴溶液，摇匀，再加入数滴1CuSO4溶液，随加随摇，溶液，随加随摇，观察实验现象。观察实验现象。111、酪蛋白含量（、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白酪蛋白g/10mL 100%2、酪蛋白得率、酪蛋白得率=测定含量测定含量/理论含量理论含量100%3、酪蛋白溶于哪些溶液？、酪蛋白溶于哪些溶液？4、酪蛋白的双缩脲反应分析。、酪蛋白的双缩脲反应分析。五、实验结果、计算与分析五、实验结果、计算与分析 12酪蛋白酪蛋白+蒸馏水蒸馏水+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+10%氯化钠氯化钠+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+0.5%碳酸钠碳酸钠+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+0.1mol/L氢氧化钠氢氧化钠+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+0.2%盐酸盐酸+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+饱和氢氧化钙饱和氢氧化钙+数滴数滴1%硫酸铜硫酸铜酪蛋白酪蛋白+10%氢氧化钠氢氧化钠+数滴数滴1