注射用人脐带间充质干细胞质量研究资料及文献资料

1、药品名称注射用人脐带间充质干细胞资料工程名称.质量研究的试验资料及文献资料缩略词对照表错误!未定义书签.1细胞形态62细胞计数62.1 供试品,仪器设备62.2 测试方法62.3 测定结果62.4 活率73.1 供试品,仪器设备73.2 测试方法73.3 检测结果84细胞外表抗原分析84.1 供试品,仪器设备及试剂84.2 测定方法94.3 测定结果95无菌需氧菌、厌氧菌和真菌105.1 供试品,仪器设备105.2 测定方法105.3 测定结果106支原体检测116.1 供试品及仪器设备116.2 测定方法116.3 测定结果117细菌内毒素127.1 供试品及仪器设备127.2 测定方法12

2、7.3 测定结果128染色体检查128.1 测定方法138.2 仪器设备和试剂138.3 实验操作138.4 细胞连续传代后的染色体检查138.4.1 实验方案138.4.2 测定结果148.5 种子细胞和成品细胞的染色体检查148.6 结果分析159成骨成脂诱导分化潜能159.1 细胞连续传代后的成骨成脂诱导分化潜能159.1.1 实验方案159.1.2 染色法159.1.3 PCR方法169.1.4 传代细胞诱导分化潜能实验结果179.2 种子细胞和成品细胞的成骨成脂诱导分化潜能189.3 实验结论：1910端粒酶活性分析1910.1 实验方案2010.2 仪器设备和试剂2010.3 实验

3、方法2010.4 实验结果2110.5 实验结论2211原癌基因与抑癌基因检测2211.1 实验方案2211.2 仪器设备和试剂2311.3 实验方法:2311.4 实验结果:2511.5 结论2512二甲基亚根(DMSO)残留检测2512.1 检测方法2612.2 检测结果2613拟定的质量标准(草案)2713.1 种子细胞P2质量标准草案2713.2 成品细胞P4的质量标准草案2813.3 成品发放细胞P4质量标准草案29附图错误!未定义书签.注射用人脐带间充质干细胞质量研究工作试验资料及文献资料本品系由存在于新生儿脐带中的间充质干细胞,经过别离、接种、培养、传代、冻存、复苏等步骤制得的细

4、胞悬液,含适宜保存液.本项研究拟选取三批注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞和六批注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞进行质量研究和分析,所采用的样品按本套申报资料9号,10号制备.供试品制备：供试品名称：注射用人脐带间充质干细胞本研究各实验工程所用供试品来源,代次和批次信息如下表11-1：表11-1质量研究用样品来源,代次及批次信息细胞代次细胞来源规格批次P2代种子细胞2xl07个/,管12802000431202100J2802000011202100J2802000171202100P4代成品细胞5xlO7个/管12802000011403000,12802000011404000,

5、1280200001140500012802000011409000,12802000011410000J2802000011413000另取三根脐带编号：UMSC5029,UMSC5024,UMSC5039,参考本申报资料9,资料10的生产工艺,进行别离,接种,传代,扩增,细胞传至P10代,其中在P2代,P4代分别冻存,检测P0,P2,P2,冻存后复苏,P4,P4,冻存后复苏,P6,P10各代次细胞染色体核型,成骨成脂诱导分化潜能,端粒酶活性分析,原癌基因、抑癌基因分析,考察传代10代内和两次冻存对上述细胞生物学活性的影响.1细胞形态仪器设备：奥林巴斯1X71倒置显微镜显微镜下观察三批P2代

6、注射用人脐带间充质干细胞种子细胞(批号12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100),六批P4代注射用人脐带间充质干细胞成品细胞(批号12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000),细胞贴壁生长时,呈梭形,为成纤维样细胞.2细胞计数2.1供试品,仪器设备供试品：注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞,P4代成品细胞P2代种子细胞批号：1280200043120210

7、0,12802000011202100,12802000171202100P4代成品细胞批号：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000仪器设备：CASY-TT快速细胞分析仪检测2.2 测试方法快速细胞分析仪检测法.取分装完成的整管细胞,充分混匀后迅速吸取定量细胞重悬液,并以氯化钠注射液或PBS稀释10-20倍,制成终浓度为1.0x105个/ml3.0xl()6个卷的单细胞悬液,取一个CASY-CUP样品杯,装入10mlCA

8、SY-TON缓冲液.将定量的样品参加缓冲液,盖紧盖子,倒转CASY杯子3次混匀样品,防止气泡和泡沫的形成.将待测样品放在毛细管的下面,使钳金电极浸没在样品中,旋转样品台,豁口朝向一边.CASY快速细胞计数仪开机检测,5min内完成样品的计数检测.显示器上读取检测数据.细胞计数结果应为“标示量的90%120%.2.3 测定结果细胞计数检查结果如下表11-2.检测图谱见附图02-0102-09.表11-2各批次细胞计数检测结果细胞代次细胞批次检测方法检测结果(个/管)P2代种子细胞样品12802000431202100快速细胞分析仪检测法.2.3x107个/管128020000112021002.

9、0x107个/管128020001712021002.4x107个/管P4代成品细胞样品128020000114030005.5x107个/管128020000114040005.6x107个/管128020000114050005.3x.个/管128020000114090005.8X107个/管128020000114100005.4x107个/管128020000114130005.8X107个/管3细胞活率3.1供试品,仪器设备供试品：注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞,P4代成品细胞P2代种子细胞批号：12802000431202100,12802000011202100,128

10、02000171202100P4代成品细胞批号：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000仪器设备：CASY-TT快速细胞分析仪检测3.2测试方法快速细胞分析仪检测法.取细胞悬液,以氯化钠注射液或PBS稀释102.倍,制成终浓度为1.0x105个/ml3.0xl()6个/川的单细胞悬液,取一个CASY-CUP样品杯,装入10mlCASY-TON缓冲液.将定量的样品参加缓冲液,盖紧盖子,倒转CASY杯子3次混匀样品,防止气泡和

11、泡沫的形成.将待测样品放在毛细管的下面,使钳金电极浸没在样品中,旋转样品台,豁口朝向一边.CASY快速细胞计数仪开机检测,5min内完成样品的计数检测.显示器上读取检测数据.细胞活率“应不低于85%.33检测结果细胞活率检测结果见下表11-3.检测图谱见附图03-0103-09.表11-3各批次细胞活率检测结果细胞代次细胞批次检测方法检测结果P2代种子细胞样品12802000431202100快速细胞分析仪检测法.93.6%1280200001120210092.8%1280200017120210094.1%P4代成品细胞样品1280200001140300093.2%12802000011

12、40400093.2%1280200001140500092.9%1280200001140900093.2%1280200001141000093.5%1280200001141300092.4%4细胞外表抗原分析通过流式细胞术(FCM)对间充质干细胞外表抗原特征进行检测,考察注射用人脐带间充质干细胞的表型特征.4.1供试品,仪器设备及试剂供试品：注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞,P4代成品细胞P2代种子细胞批号：12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100P4代成品细胞批号：12802000011403000,128020

13、00011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000仪器设备：流式细胞仪(FACSCaliburorFACSArial)实验试剂：CD73-PE单克隆抗体、CD90-FITC单克隆抗体、CD105-APC单克隆抗体、CD29-PE单克隆抗体、CD45-FITC单克隆抗体、CD34-PE单克隆抗体、CD14-FITC单克隆抗侬CD79a-APC单克隆抗体或CD19-APC单克隆抗体、HLA-DR-PerCP单克隆抗体、以及相应的同型对照抗体BD公司4.2 测定方法流式细胞术.将样品移

14、入相应流式管内,参加ImlPBS充分混匀,500g离心5分钟,弃上清,重复洗涤2次；参加适量PBS混悬细胞,过滤,计数,将细胞浓度调整为2.06.0x106个/ml待用；取出假设干支流式管,参加各组抗体及同型对照试剂避光操作；然后将准备好的细胞样品参加已参加抗体试剂的流式管内,每管100W,充分混匀,置4c冰箱避光孵育30分钟；孵育完成后每管参加ImlPBS,充分混匀,500g离心5分钟,弃上清液,重复此洗涤过程1次,调整细胞悬液体积至200Ml左右,准备上机检测.4.3 测定结果结果见表11-4.检测图谱见附图04-0104-30.表11-4细胞表而抗原检测分析实验结果细胞代次细胞批号流式检

15、测指标检测结果CD90CD29CD73CD105CD45CD34CD19/CD79aCD14HLA-DRP2代种子细胞样品1280200043120210099.7%99.9%99.6%98.4%13%0.5%1.1%1.0%0.2%合定符规1280200001120210099.9%99.8%95.8%99.7%1.0%1.5%0.9%0.5%0.6%合定符规1280200017120210099.9%97.2%99.9%99.7%1.2%1.0%1.0%0.9%0.7%合定符规P4代成品细胞样品1280200001140300099.8%97.1%97.1%99.6%1.5%0.8%1.1

16、%1.0%0.7%合定符规1280200001140400099.9%98.4%98.4%99.7%1.8%1.1%1.7%1.2%0.5%合定符规1280200001140500099.4%97.6%964%95.7%13%0.9%0.9%1.0%03%合定符规1280200001140900095.5%99.5%95.5%96.5%0.7%1.2%0.2%0.8%0.8%合定符规1280200001141000098.6%98.3%95.0%98.4%1.2%0.2%2.0%1.1%1.0%合定符规1280200001141300099.8%99.8%97.9%99.8%0.9%1.1%1

17、.7%1.3%1.1%合定符规5无菌需氧菌、厌氧菌和真菌5.1 供试品,仪器设备供试品：注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞,P4代成品细胞P2代种子细胞批号：12802000431202100,12802000011202100,12802000171202100P4代成品细胞批号：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000仪器设备：仃级超净工作台,BacT/ALERT3D120全自动细菌分枝杆菌培养监测检测系统5.2

18、测定方法全自动细菌分枝杆菌培养监测检测系统.万级洁净室、局部白级洁净工作台中操作.每批次取1管细胞,生理盐水稀释至812ml,一次性无菌注射器取样接种先接种厌氧瓶BPN,后接种需氧瓶BPA,接种厌氧瓶时防止吸入空气,接种过程严格根据无菌操作标准进行消毒及操作,每个BPA及BPN瓶接种量均为4-6ml；接种后上机培养及检测,培养温度351,培养周期14天,检测时限内每天至少观察3次.检测结果应为“阴性.5.3 测定结果结果见表11-5.表11-5各批次细胞无菌检测结果细胞代次细胞批次检测方法检测结果P2代细胞种子细胞样品12802000431202100全自动细菌分枝杆菌培养监测检测系统阴性12

19、802000011202100阴性12802000171202100阴性P4代成品细胞样品12802000011403000阴性12802000011404000阴性12802000011405000阴性12802000011409000阴性12802000011410000阴性12802000011413000阴性6支原体检测根据?中国药典?2021版第三部附录XIIB,选取直接培养法及DNA染色法依法检测.6.1 供试品及仪器设备供试品：注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞,P4代成品细胞P2代种子细胞批号：12802000431202100,12802000011202100,1280

20、2000171202100P4代成品细胞批号：12802000011403000,12802000011404000,12802000011405000,12802000011409000,12802000011410000,12802000011413000仪器设备：电热恒温培养箱、荧光倒置显微镜、CCh培养箱6.2 测定方法?中国药典?2021版第三部附录刈B依法检测.6.3 测定结果结果如下表11-6：表11-6各批次细胞支原体检测结果细胞代次细胞批次检测方法检测结果P2代种子细胞样品12802000431202100?中国药典?2021版第三部附录刈B符合规定1280200001120

21、2100符合规定12802000171202100符合规定P4代成品细胞样品12802000011403000符合规定12802000011404000符合规定12802000011405000符合规定12802000011409000符合规定12802000011410000符合规定12802000011413000符合规定7细菌内毒素根据中国药典2021版第三部附录刈E?细菌内毒素检查法?之凝胶法依法检测.7.1供试品及仪器设备供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞P4代成品细胞批号：12802000011403000,12802000011404000,1280200001140

22、5000,12802000011409000,12802000011410000,128020000114130007.2 测定方法依中国药典2021版第三部附录XIIE检测,应“V0.5EU/ml.7.3 测定结果结果如下表11-7：表11-7细菌内毒素检定结果细胞代次细胞批号检测方法检测结果P4代成品细胞12802000011403000中国药典2021版第三部附录刈E0.5EU/ml128020000114040000.5EU/ml128020000114050000.5EU/ml128020000114090000.5EU/ml128020000114100000.5EU/ml1280

23、2000011413000k-ras.c-fos在不同代次的变化,对P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次细胞原癌基因、抑癌基因进行检测,考察不同代次的培养细胞原癌基因、抑癌基因的表达.同时对三批P2代种子细胞样品,2个规格六批成品细胞样品P4,复苏后以及对应的一批种子细胞P2,复苏后的原癌基因、抑癌基因进行检测,考察中试生产规模下P2代,P4代细胞的原癌基因和抑癌基因的表达.11.2 仪器设备和试剂仪器设备：SIGMA,3K15冷冻离心机分光光度计NANOPHOTOMETER普通PCR仪,荧光定量PCR仪主要试剂：RNA试剂盒逆转录试剂盒美国伯乐公司BIO-RAD,ALS1296美国伯

24、乐公司BIO-RAD,CFX-96凯杰公司QIAGEN74204TOYOBOFSK-100SybergreenMix宝生物工程TAKARA11.3 实验方法分别根据RNA试剂盒的使用说明书提取RNA,以提取RNA所用的无RNase水作为空白对照,用紫外分光光度计检测抽提RNA的浓度与纯度.cDNA逆转录试剂盒使用说明将RNA反转录成cDNA,SybergreenMix试剂盒将目的基因定量PCR检测,检查间充质干细胞抑癌基因P53、P21、RB及原癌基因c-Myc、k-ras、c-fos的表达.详细操作参考11.3.111.3.411.3.1 RNA提取参照试剂盒说明书细胞收获与裂解：细胞经由胰

25、酶消化之后,300g,5min离心,去除上清；按细胞数目参加适量的BufferRLT裂解.细胞数目一般为lXlO,漩涡震荡混匀.参加与BufferRLT等体积的70%乙醇至细胞裂解液中,轻轻吹打混匀.将包含有沉淀所有的700用的样品转移至离心柱中,轻合管盖.12,OOOrpm离心15s.去除收集管内的流出液,收集管继续使用.4参加700同BufferRW1至离心柱中,轻合管盖.12,OOOrpm离心15s,更换新的收集管.参加500N1BufferRPE至离心柱中,轻合管盖.12,OOOrpm离心15s.去除收集管内的流出液,收集管继续使用.6加500N1BufferRPE至离心柱中,轻合管盖

26、.12,OOOrpm离心3min.废液和收集管丢弃,更换1.5ml灭菌的EP管为收集管.7直接参加30-50N1无RNase水.轻合管盖,12,OOOrpm离心1min.收集1. 5mlEP管中的RNA,可-20或-80保存备用.11.3.2 RNA质量检测方法以提取RNA所用的无RNase水作为空白对照,用紫外分光光度计检测抽提RNA的浓度与纯度.11.3.3 RNA反转录成cDNAT0Y0B0公司的FirstStrandcDNASynthesisKito.转录反响体系：RNaseFreeH：0(ll-X)Pl5XRTBuffer4同dNTPMixture(lOmM)2P1RNaseInhi

27、bitor(10U/P1)1P1RandomPrimer(25pmol/Ml)1H1RNA(1Ng)XP1ReverTraAce1P1总体积：20间转录过程：30ClOmin42C20min99C5min4C5min瞬间离心Real-timePCR：B-actin为内参,P0的细胞为对照.反响体系：2xsybyGreeen：5M1cDNA：0.4P1PrimerForward：0.1P1PrimerReverse：0.1P1H：0：4.4M1每个孔lOul的反响体系,每个基由于3个平行样.使用BioRadReal-TimePCR仪扩增.RT-PCR反响步骤：95C30s60cC30s72CIm

28、in39循环11.3.4 数据分析应用BIORADCFX.Manager导出实验数据,并使用2-Ct方法分析实验数据,检测相关原癌基因与抑癌基因的表达是否发生明显变化.11.4 实验结果1各代次细胞癌基因、抑癌基因检测结果：三根脐带样本UMSC5029、UMSC5024、UMSC5039连续传代,P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次细胞原癌基因、抑癌基因检测结果说明：连续传代培养及冻存复苏过程不会对原癌基因、抑癌基因表达产生显著影响.检测结果如附图11-01.2三批P2代种子细胞样品原癌基因、抑癌基因检测结果：三批种子细胞样品12802000431202100,128020000112

29、02100,12802000171202100冻存前后原癌基因、抑癌基因检测结果说明：P2代种子细胞冻存复苏过程不会对原癌基因、抑癌基因表达产生显著影响.检测结果如附图11-02：3成品质量研究癌基因、抑癌基因检测结果：对2个规格六批次的成品细胞P4,复苏后及对应的一批种子细胞P2,复苏后进行了原癌基因、抑癌基因检测,结果说明：以P2代种子细胞作为对照表达组,传代培养的P4代成品细胞原癌基因、抑癌基因表达不发生明显改变.检测结果如附图11-03：11.5 结论通过对三根脐带样本传代培养扩增,P0、P2、P2P4、P4P6、P10各代次细胞原癌基因、抑癌基因检测,结果说明：传代至P10细胞,原癌

30、基因、抑癌基因表达没有显著性改变,传代10代内和冻存对干细胞原癌基因、抑癌基因表达没有显著影响.三批种子细胞样品和2个规格六批成品细胞的原癌基因、抑癌基因检测,实验研究结果说明：脐带间充质干细胞采用现有生产工艺培养得到的P2代种子细胞,P4代成品细胞,中试规模生产下,各代次细胞的原癌基因与抑癌基因表达不发生明显改变.12二甲基亚碉DMSO残留检测P4代成品细胞冻存前均参加含DMSO成份的冻存液,复苏后根据细胞复苏发放程序操作,洗涤去除DMSO溶液,参加保存液后成品注入人体,为考察成品细胞临床使用前DMSO残留量,特取本规格P4代成品细胞六批,根据干细胞复苏标准操作规程,洗去冻存液参加保存液,送

31、检DMSO残留.12.1 检测方法根据?中国药典?2021版第三部附录VIV第三法.12.2 检测结果六批P4代成品细胞复苏后DMSO残留含量检测结果如下表11-16.检验报告见附图12-01-12-06o表11-16注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞DMSO残留含量检测结果样品规格批次检测方法检测结果P4代成品细胞5x10?个/份12802000011403000?中国药典?2021版第三部附录VIV第三法0.01%128020000114040000.01%128020000114050000.01%128020000114090000.01%128020000114100000.01%128020000114130000.01%检验结果说明：6批成品细胞复苏后经过两次洗涤,DMSO残留量