乳酸菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究

1、第29卷第4期1998年12月东北农业大学学报JournalofNortheastAgriculturalUniversity29(4):371379December1998乳酸菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究()、山梨醇、甘油、侧金盏花醇等13种材料对乳酸菌的冻干,海藻糖,侧金盏花醇为最佳保护剂,其次为蔗糖、麦芽糊精、山梨醇、谷氨酸钠、脱脂奶粉,在以水和增菌液为基质中冻干保护效果显著,对乳球菌的保护效果优于乳杆菌。冻干菌物菌落总数与菌体产酸力有一定关系,但与乳糖酶关系不明确,冻干后的菌体表面呈脑回样皱褶,但形态变化不大。并设计了最佳冻干保护剂配方。关键词乳酸菌,冻干保护剂,筛选中图分类号S

2、939.117的冻干保护剂。0前言1材料与方法冷冻保藏与冻干技术是生物学的一个重要应用技术,近年来这一技术因“功能性(FunctionFood)的快速发展而被用食品”于食品生产中,此外,商品化乳酸菌发酵剂的制备也常用此技术。然而,欲获得理想的冷冻及冻干效果,除工艺外,主要是筛选与使用适宜的冻干保护剂(Cryoprotect-1ants),目前,有关冻干保护剂的研究主要集中于医学,生物学领域,是冷冻生物学分支的主要内容之一。但是,用于生产发酵剂的冻干保护剂的研究大多属于专利资料,而且,许多研究的报告结果差异很大。本试验利用现有条件,以蔗糖、海藻糖、侧金盏花醇等糖、醇、氨基酸、盐类对乳酸菌的冻干保

3、护效果进行了比较研究,从而筛选良好收稿日期:1998-03-131.1材料1.1.1悬浮基质生理盐水、CMR增菌液、无脂乳固体量(NFS)为11%的脱脂复原乳,经105灭菌20min。1.1.2供试菌种ST-1(嗜热链球菌),LB-1(保加利亚乳杆菌),LA-1(嗜酸乳杆菌),SL(乳链球菌)。上述菌种均为本室收藏。1.1.3冻干保护剂蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、甘露醇、甘油、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、偏磷酸钠、-磷酸甘油二钠、谷氨酸钠、右旋糖苷,侧金盏花醇等均为分析纯试剂或生化试剂,谷氨酸钠为食品级,含量为99%。1.1.4真空冷冻干燥机ALPHI-5型,德国造。372东北农业大学学报

4、第29卷1.1.5菌落计数培养基CMR。(配方:蛋0.3%聚乙烯醇缩甲醛氯仿溶液的网吸咐5min,在室温下干燥,再用2%的磷钨酸(pH6.8)负染色1.52.0min,干后在电镜白胨5g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,乳糖10g,乙酸钠2g,硫酸锰0.25g,硫酸镁0.25g,吐温-801g,乳蛋白水解物5g,-磷酸甘油二钠5g,蒸馏水1000mL,琼下观察。B.扫描电镜观察:将样品用双面胶带脂(20g)。1.1.6真空封口器与真空泵:本所自备。1.2方法1.2.1贴于扫描电镜样品台上,放入B-5型离子溅射仪中,150t)KyKy-1。,0.5mLh2结果与讨论2.1冷冻保护剂(单因素多水平)筛

5、选试。冻干56h后逐渐升高加热板温度至15,以排出剩余的水分,使冻干制品的水分含量为1.50%2.50%,然后用于测定菌落总数,水分活度,验415将供试菌株ST-1在CMR增菌液中培养24h,离心(3000rmin-1×5min),弃上清,生理盐水洗二次后,加入灭菌的CMR培养基25mL,使其最后的菌落数为3.5×109mL-1,然后,分装为25份菌液,扫描和透射电镜观察菌体。1.2.2菌落总数测定按国标GB4789.2-842方法测定,稀释液为灭菌生理盐水。于37下,CO2浓度为10%,培养72h。1.2.3水分活度测定将冻干物料加于测每份菌液加入二倍浓度的保护剂溶液,充

6、分混匀,置于冰柜冷冻及冷冻真空干燥。其菌落计数结果见表1。从表1发现:海藻糖对ST-1的冷冻保护作用与侧金盏花醇的保护作用相近,为最佳保护剂,但因这两种材料均是十分昂贵的糖、醇类,无法应用于工业生产之中。保护作用较好的蔗糖、乳糖、麦芽糊精、山梨醇、甘油、谷氨酸钠均可用于生产乳酸菌发酵剂。这一结果与国外许多学者的研究相近,然而测定值却低于国外的有关报导数值,究其原因,可能是菌悬液的冻结速度慢,冻结温度低有关。从水分活度值可见,海藻糖与蔗糖的值较低,说明两种糖水化能力强,与细胞膜表面易形成较稳定水化保护层,使水分冻结时形成小的冰晶,提高其冻干保护效果,这一测值与冻干保护的试验结果相吻合。定平皿内按

7、上述工艺冻干后,采用Nova-sina水分活度测定仪测定。1.2.4菌种活力测定通过测定菌种产酸力来评价菌种的活力。酸度测定按GB5409-89方法测定,每一冻干管中加入5mL2灭菌脱脂复原乳(NFS为11%)于37培养5.50h后测定滴定酸度0T。乳糖酶活力测定:参照潘道东论文3,加入1mL缓冲液,溶解出菌粉,离心6000rmin-110min取上清0.5mL加入ONPG3mL,混匀,于37水浴中反应15min,再加入3mL1MNa2CO3中止反应,在420nm处测定吸光度值。1.2.5冻干菌物电镜观察A.透射电镜观察冻干菌体:挑取冻干菌物,用过滤除菌的蒸馏水浸溶,用涂有第4期吕加平等:乳酸

8、菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究373表1冻干保护剂的筛选试验结果Table1Screeningtestofcryoprotectantforlacticacidbacteria(ST-1)冻干保护剂Cryoprotectants冻干前菌数冻干后菌数浓度(W W)-1-1cfumLcfumLConcentrationTotalviableTotalviableofcountsbeforecountsaftercryoprotectantsFreeze-dryingFreeze-drying5%10%5%5%10%20%5%10%20%5%555%5%5%3.5×1093.59593

9、.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1092.2×10×1091.87×1091.86×1092.1×1091.42×1091.93×1092.36×1092.35×1091.89×1091.23×1091.56×1091.36×10

10、9存活率水分活度(%)AwSurvivalWaterrateActivity(%).42.8551.0053.0053.160.0040.5755.1467.4367.1454.0035.1444.5738.860.4620.4270.423海藻糖(Trehalose)乳糖(Lactose)0.45(se)麦芽糊精(Maltodextrin)侧金盏花醇(Adonitol)山梨醇(Sorbitol)甘露醇(Mannitol)甘油(Glycerin)三聚磷酸钠(Sodiumtripolyphosphate)焦磷酸钠(Sodinmpyrophosphate)5%3.5×1091.29

11、15;10936.86偏磷酸钠(Sodiunmetaphosphate)-磷酸甘油二钠(Sodium-glycerophosphate)5%3.5×1091.15×10932.855%5%5%5%3.5×1093.5×1093.5×1093.5×1093.5×1091.87×1091.24×1091.95×1091.68×1094.28×10854.4335.4355.714812.23右旋糖苷(Dertran)谷氨酸钠(Glutamate-Na)精氨酸(Arginine)增

12、菌液(Multiplebroth)生理盐水(Salinesolation)3.5×1097.52×1070.22374东北农业大学学报第29卷表2不同悬浮基质保护效果的比较(试验菌为ST-1)(cfumL-1)Table2Comparisonofcryoprotectionindifferentsuspensionmedium保护剂(Cryoprotectant)悬浮基质Suspensionmedium生理盐水(Saline)3.25×1061.87×106×1061.×1061.43×1061.20×104增菌液

13、(CMRbroth)6.40×1063.×1063.63.40×1062.64×1064.60×105脱脂复原乳(NFS11%)(Skimmilk)7.80×1072074.10×1073.60×1073.12×1072.00×107海藻糖(10%)(Trehalose)蔗糖(10%)(Sucrose)麦芽糊精(10%)(Maltodextrin)(l)(10%)(Glutamate-Na)空白对照(Controlgroup)表3保护剂对不同乳酸菌的保护作用(cfumL-1)Table3Thee

14、ffectofcryoprotectantsonvariouslacticacidbacteria冷冻保护剂Cryoprotectants未冻干前菌落数(Totalcfuofundryedsample)海藻糖(10%)(Trehalose)麦芽糊精(10%)(Maltodextrin)山梨醇(10%)(Sorbitol)蔗糖(10%)(Sucrose)谷氨酸钠(5%)(Glutamate-Na)侧金盏花醇(5%)(Adonitol)脱脂复原乳(NFS12%)(Skimmilk)乳酸菌(Lacticacidbacteria)ST-18.60×1088.10×108(94.2%

15、)7.30×108(84.9%)6.70×108(77.9%)7.20×108(83.72%)6.40×108(74.4%)7.90×108(91.8%)4.60×108(53.48%)LB-11.23×1089.80×107(79.67%)7.90×107(64.22%)6.70×107(54.47%)8.70×107(70.73%)5.10×107(41.46%)9.30×107(75.61%)2.96×107(24.06%)LA-16.70×

16、;1085.70×108(85.07%)5.20×108(77.61%)3.70×108(55.22%)5.30×108(79.10%)3.40×108(50.75%)4.50×108(67.16%)2.21×108(32.98%)SL7.30×1086.60×108(90.41%)4.40×107(60.27%)6.10×108(83.56%)5.90×108(80.82%)4.30×108(58.9%)5.40×108(73.97%)3.24×

17、;108(44.38%)注:括号内的数据为冷干后乳酸菌存活率(%)第4期吕加平等:乳酸菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究3752.2不同悬浮基质对冷冻保护效果的影响从表2可以看出,悬浮基质不同,冻干保护剂的保护效果也不同,其保护效果在以水和增菌液为基质时表现的十分显者,加保护剂后与未加保护剂的菌数相比可以增加118268倍(水),5.7013.91倍(增菌液),1.563.90倍(脱脂复原乳)(NFS11%)。主要原因是脱脂复原乳为良好的冻干保护剂,而且测定结果是在冻干之后就测定的菌落总数。,脂乳。NFS的含量达15%20%为宜。2.3保护剂对不同菌种的保护作用选取NFS为12%的脱脂乳为悬浮

18、基质,将菌浓缩悬浮液加入灭菌脱脂乳中,使其最后的菌落总数为103cfumL-1,然后将上述四种脱脂乳菌悬液按0.25ml的量分别分装于12管(冻干管)中,每管再加入0.25ml二倍浓度的冻干保护剂溶液(过滤除菌),涡流混合置冰柜冻结,真空冻干后立即测定菌落总数,具体试验结果见表3。表3的实验数据可以看出,各冻干保护剂对不同菌保护作用有一定差异,其中海藻糖与侧金盏花醇对各种菌的保护作用均保持较高的水平(存活率)。麦芽糊精对SL的保护效果稍差,仅为60.27%,与脱脂乳的水平相近。谷氨酸钠与其它同水平的保护剂相比其效果最差。另外,六种冻干保护剂对嗜热链球菌和乳酸链球菌冻干保护作用优于对乳杆菌的保护

19、,这一结果同其他研究报导相比虽在趋势方面是相同的,但各保护剂对保加利亚乳杆菌的保护效果要高于同类研究报告的数据11,这可能与该菌对冷冻及真空干燥的应激处理抗性较强有关。有关乳酸菌对热、冷剌激抗性在本试验未做更详细的比较研究。但本项试验中选用的ST-1与SL均为粘性较大的菌株,其生长中产生的胞外多糖使菌体对冷、热抗性可能有一定影响。2.4最佳保护剂优化配方设计根据菌体冻伤及冻干保护机理,结合各保护剂的保护效果与作用特点、保护剂的来源、性状,选取A,B,C,D四种保护剂为试验因素,采用L16(45),4,A,B,C三因素的极差大于误差项的极差,而C因素的极差值却小于误差极差值,说明A,B,D项对菌

20、落总数的影响是显著的,而C因素的影响在实验水平内不显著,但仍然有一定的保护作用。四因素影响程度大小依次为ADBC,最佳配方组合为A4B4C3D4,本实验为了使实验结果及各因素的影响更显著,选取的悬浮基质为生理盐水,若在实际中使用NFS为11%脱脂复原乳,则各保护剂的配合水平还可下调,同样可以达到保护效果。2.5冻干保护剂对菌体生物学特性的保护作用在筛选保护剂时,一般均采用菌落总数作为可靠的评价指标,但是菌落总数的测定工作繁杂,极易造成污染而使菌落无法计数,因而本试验测定了保护剂对菌体活力的影响(主要是产酸力和乳糖酶活力)具体结果见表5。表5的结果表明,冻干保护剂对乳酸菌乳糖酶释放量有一定影ST

21、-1的产酸力、响。本试验曾选取发酵8.5h为测定时间,结果使各试验组的酸度无明显差异,其原因是受伤的菌体在短时间得以修复而恢复了产酸力。以5.5h发酵时间则可揭示各试验组的活力差异。产酸效果与菌落总数测定值基本一致。但是,冷冻保护剂对菌体乳糖酶的影响不大,酶活性与产酸力、菌存活率相差较大。从另一侧面也说明真空冷冻干燥法376东北农业大学学报第29卷对菌体破裂性损伤很小。产酸力与菌存活率之间虽有一定相关性,但目前尚难以确定精确的相关关系。因此,在评价冻干保护剂保护效果时仍以菌落总数值为判定标准,产酸力仅可作为参考指标。表4冷冻保护剂优化配方正交试验设计与结果分析表Table4Thedesigna

22、ndresultanalysisoforthogonalitytestoptimizingofcryorotectantsA(Sucrose)12345678910111213141516K1K2K3K4k1k2k3k4R23434124321214338.280.8119.9122.39.5520.229.8830.5821.03B(Maltode-)23421433412432173.179.9104104.218.2819.982626.057.77C(l123412341234123494.785.998.68223.6821.4824.6520.54.15D-111122223333

23、444486.164.56104.5106.121.5316.1426.1326.5310.391234432121433412100.378.182.6100.225.0819.5320.6525.055.55TotalViablecountsX×107(cfumL)7.812.432.533.424.516.85.617.635.638.424.06.526.818.336.524.52.6冻干发酵剂电镜观察A.透射电镜观察:见图1。B.扫描电镜观察:见图2。从图片可以看出,不同保护基质基冻干菌物的构造有显著区别,脱脂乳基质呈粗大的网格构造,而麦芽糊精等复合基质则呈较细的网孔构造

24、,在图2、A2、B2图片中的网格条梁上可以看到凸起呈球形的构造,可能是菌体。特别是图片B2可看到呈串珠样的隆起构造,说明不同基质对菌体的保护作用不同还体现在菌体形态与菌物构造方面。冻干时若有良好的保护基质,菌体的形态可以保持不变或变化很小。但是菌体表面却有一定的皱缩现象呈脑回样。(见图1)菌体第4期吕加平等:乳酸菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究377表5冻干保护剂对菌体产酸力与乳糖酶活力的影响Table5Influenceofcryoproteetantonacidityandlactaseactivityoflacticacidbacteria保护剂Cryoprotectant浓度Conc

25、entration10%10%%2.0%滴定酸度TTiratableacidity28262526乳糖酶活力(A420)3ActivityofLactase(420).0080410.0400.0070.0230.027蔗糖(Sucrose)海藻糖(Trehalose)侧金盏花醇(Adonitol)山梨醇(l(Sodiumtripolyphosphate)焦磷酸钠(Sodiumpyrophospate)-磷酸甘油钠(Sodium-glycerophosphate)2.0%210.0402.0%10%10%2831250.0270.0100.027麦芽糊清(Maltodextrin

26、)乳糖(Lactose)图1冻干发酵剂透射电镜图谱Fig.1Transmissionelectronmicrographsoffreezedryingstarter呈球杆状。加入保护剂则可与胞壁结合,避免膜的粘连、破裂而菌体死亡,不同保护剂菌体透射电镜观察结果无明显差别。有关冻干菌物的电镜观察报导极少,许多问题有待今后深入研究。以期揭示冷冻损伤与保护机理,筛选更为理想实用的冻干保护剂。378东北农业大学学报第29卷2A乳悬浮液基质样2AMlikSuspension2B麦芽糊精悬浮液基质样2BMaltodextrinmixedSoiution图2冻干发酵剂扫描电镜图谱Fig.2Scanninge

27、lectronmicrographsoffreezedryingstarter3结论3.1对蔗糖、海藻糖等十多种糖、醇类的冷交设计完成,以A4B4C3D4为最佳配方组合。3.5发酵剂菌体在冷冻干燥后,其菌落总数与产酸力呈一定关系,但与乳糖酶活力无明确联系。3.6在适宜的冻干保护基质中冻干的菌体冻保护效果的比较研究表明,海藻糖与侧金盏花醇的冻干保护效果最好,其次是蔗糖、麦芽糊精、山梨醇;脱脂乳仍是实用的效果较好的冻干保护基质。3.2各冻干保护剂在生理盐水和增菌液悬浮基质中的保护效果显著。3.3冻干保护剂对不同菌体的保护力有明显差异,对球菌的保护效果要优于对乳杆菌的保护效果。3.4最佳冷冻保护剂的

28、配方设计可采用正形态变化不大,菌表面呈脑回样皱褶。不同基质菌物的构造不同。参考文献1Robinson.R.19852中国预防医学科学院标准处.食品卫生国家标准汇编K.Dairymicrobiology.NewYork.中国标准出版社,北京.19883潘道东,乳糖酶与脆壁酵母细胞的固定化及其特性研究,东农硕士论文.1990第4期吕加平等:乳酸菌发酵剂冻干保护剂筛选及应用的研究.1993(76):19021907Sci3794吕加平,骆承庠,冻干保护剂的研究及其应用,中国畜产与食品(专辑)1996,42505Johnson.J.A.C.etal.Propertiesoflactobacillush

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