营养缺陷菌株筛选

1、2 2 筛选策略筛选策略（1） 基本概念 营养缺陷型 (auxotroph) 某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。 野生型（ wild type ）：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。 原养型 (prototroph) ：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。 基本培养基 (mm) 能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。 补充培养基 (sm) 凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的培养基。在 mm 中加蛋白胨（多种氨基酸 ) 便可以用来培养各种氨基

2、酸的缺陷型；加入酵母浸膏 ( 其中含有多种 b 族维生素和核苷酸 ) 便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。 完全培养基 (cm) 凡能满足一切营养缺陷型生长需要的培养基。 营养缺陷性突变株营养缺陷性突变株与营养要求有关的三类遗传型与营养要求有关的三类遗传型2）营养缺陷型的筛选办法）营养缺陷型的筛选办法诱变剂处理诱变剂处理淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印接种法影印接种法鉴定缺陷型鉴定缺陷型菌丝过滤法菌丝过滤法抗生素法抗生素法淘汰野生型：淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例较低在诱变后的存活个体中，

3、营养缺陷型的比例较低（百分之几千分之几）。需选用适当的方法淘汰为数众多的（百分之几千分之几）。需选用适当的方法淘汰为数众多的野生型菌株，达到野生型菌株，达到“浓缩浓缩”极少数营养缺陷型的目的。极少数营养缺陷型的目的。过滤法是使能在基本培养基上生长形成菌丝体的野生型留在滤膜上，不能生长的营养缺陷型孢子则能透过滤膜。 营养缺陷型检出营养缺陷型检出逐个检出法逐个检出法涂布涂布培养培养基本培养基上不长菌落基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基含诱变剂的液体培养基菌种菌种营养缺陷型营养缺陷型夹层检出法夹层检出法影印法影印法限量补充培养法（同一培养皿）（同一培养皿

4、） 微量蛋白胨的基本培养基上微量蛋白胨的基本培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株小菌落是营养缺陷型突变株生长谱法生长谱法 方法简便；方法简便； 回变和污染不影响回变和污染不影响 结果结果 测定物质可为粉末测定物质可为粉末 或纸片或纸片 缺陷型缺陷型的鉴定的鉴定测定一般应分两阶段：测定一般应分两阶段： 第一阶段：测定是哪类物质的缺陷第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；型； 第二阶段：根据第一阶段确定的范围，第二阶段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的进一步确定是哪种具体化合物的缺陷缺陷型；型；组合营养物法组合营养物法步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）

5、：a. 将多种营养因子编组；将多种营养因子编组；b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c. 结果分析；结果分析； 一组：一组：1 2 3 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 14 五组：五组：5 9 12 14 15营养因子分组编排时注营养因子分组编排时注意；意；1）每组内无重复的营）每组内无重复的营 养因子养因子 2）每组中应包含只出）每组中应包含只出 现一次的因子现一次的因子 3）每组中其他因子应）每组中其他因子应 分别出现二次分别出现二次如：如： 一组：一组：1 2 3

6、 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 14 五组：五组：5 9 12 14 15营养缺陷型的应用营养缺陷型的应用 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 抗阻遏和抗反馈突变型抗阻遏和抗反馈突变型 抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。合成这一产物。 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株 结构类

7、似物是指一些和结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构维生素等代谢产物结构相类似的物质相类似的物质 主要用于末端产物的积累主要用于末端产物的积累抗性突变菌株的筛选抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株抗生素抗性突变株条件抗性突变条件抗性突变 因环境不同，能表现为因环境不同，能表现为 野生型野生型 菌株的特性和突变型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 以以温度敏感突变温度敏感突变为例：为例：筛选方法：筛选方法：用途：用途：常用于提高代谢物产量常用于提高代谢物产量原因：原因

8、：是由于某一酶蛋白结构是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温下活力丧失改变后，在高温下活力丧失重要性：重要性：如果此酶为蛋白质、如果此酶为蛋白质、核酸合成途径中所需的酶，核酸合成途径中所需的酶，则此变异株在高温下的表型则此变异株在高温下的表型就是营养缺陷型。就是营养缺陷型。u在富含生物素的培养基中进行发酵时：在富含生物素的培养基中进行发酵时：u先在先在30（允许条件）中进行培养以得到大量（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（菌细胞，适当时间后提高温度（ 40 ，非允许，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。条件），即能获得谷氨酸的过量生产。应用举例应用举例v由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经，经诱变处理