(完整word版)基因工程原理练习题及其答案

1、1基因工程原理练习题及其答案、填空题1.基因工程是_年代发展起来的遗传学的一个分支学科。2.基因工程的两个基本特点是：(1)_，(2)_。3.基因克隆中三个基本要点是： _; _ 和_4 .碱裂解提取溶液 I 中的葡萄糖的作用 _ 、5同一质粒不同构型在电泳过程中迁移速率为 _ 。6.部分酶切可采取的措施有：_ (1)_等。7._ 第一个分离的限制性内切核酸酶是 ;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_。&限制性内切核酸酶 BsuRI 和 HaeM的来源不同，但识别的序列都是 _,它们属于9.DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段是用 _ 切割 DNA 聚合酶 I 得到的分

2、子量为76kDa 的大片段，具有两种酶活性：_;_ 的活性。10.为了防止 DNA 的自身环化，可用 _ 去双链 DNA_。11.EGTA 是_离子螯合剂。12._测序酶是修饰了的 T7 DNA聚合酶，它只有 _酶的活性，而没有 _酶的活性。13 .切口移位(nick translation)法标记 DNA 的基本原理在于利用 _ 的_ 和_ 的作用。14.欲将某一具有突出单链末端的双链DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_或_ 。15.反转录酶除了催化 DNA 的合成外，还具有 _ 的作用，可以将 DNA-RNA 杂种双链中的 _ 水解掉。16 . 基因工程中有 3 种主要类型的载

3、体： _、_ 、17 .就克隆一个基因(DNA 片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分:_ 、_ 、_。另外，一个理想的质粒载体必须具有 低分子量。18.琼脂糖凝胶的分辨力与胶浓度的关系是19._ 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为 _ 。20 .影响限制性内切酶活性的因素_、_21._ 连接反应的实用温度为。22.pUCI8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC 系列的载体是通过 _和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp抗性基因则是来自。23 .噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因_;二是_24._野生型的 M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是

4、 _和。25.黏粒(cosmid)是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自 _、COS 位点序2列来自 _ ，最大的克隆片段达到 _ 。26.野生型的噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1)_(2)-(3). 。27 .噬菌粒是由质粒和噬菌体 DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构 是_ ， 而来自噬菌体的主要结构是 _ 。28.噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的_的范围内。29.在分离 DNA 时要使用金属离子螯合剂，如EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是 _30.用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在 DNA 溶液中加人单价的阳离子，如Na

5、CI 和 NaAc，其目的是_。31.引物在基因工程中至少有_4 个方面的用途：. 。32. Clark 发现用 Taq DNA 聚合酶得到的 PCR 反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链 DNA 分子。根据这一发现设计了克隆PCR 产物的_。33. 在 cDNA 的合成中要用到 S1 核酸酶，其作用是切除在 _34._ 乙醇沉淀 DNA 的原理是_。35.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：_(3)_ 。36.受体细胞的感受态是 _ 。37.DNA 重组连接的方法大致分为四种：_(2)_(3)_ (4)_。38.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为

6、含有一个 _ ，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个 _。39将含有一个 mRNA 的 DNA 拷贝的克隆称作一个 _ ，源于同一批 RNA 制备物的克隆群则构建了一个 _。40._只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用 _ 可以将这段 DNA 进行百万倍的扩增。41._ 人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_ 时吸附 DNA, _ 时摄人DNA。42. 目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。大致可以分为：_ 等。43.PCR 扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于 _ 。44.核酸杂交探针可分为两大类：DNA 探针和 RNA 探针。其中 DNA

7、 探针又分为_ 探针禾廿_探针。45._ RNaseH的活性为_。46.第一个用于基因克隆的天然质粒。47._噬菌粒载体的包装需要 的帮助下才能完成。48. cDNA 文库的特点： _、_、_ 、_。349 .用_ 处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。50._ 在技术中，DNA 限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维 素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的 DNA 探针杂交。51._ 可用 T4DNA 聚合酶进行平末端的 DNA 标记，因为这种酶具有 _和_的活性。52.根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素：(1)_(2)_(3)_ 。53. Northern 印迹和 Sout

8、hern 印迹有两点根本的区别：_(2)_ 。54._ 外源基因导入植物细胞的方法有： _。答案1.702.(1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达3.克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择4增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNADNA 受机械力（震荡）的作用而降解5.超螺旋大于线性大于开环。6.（1）减少酶量；（2）缩短反应时间；（3）增大反应体积7. EcoK ； EcoRI&GGCC;异源同工酶9.枯草杆菌蛋白酶；（1）5-3 合成酶的活性；（2）3-5外切核酸酶10.碱性磷酸酶；5 端的磷酸基团11.Ca2+12.5-3 合成；3-5 外切13.DNA 聚合酶 1 :

9、5一 3外切核酸酶；5 一 3合成酶14.S1 核酸酶切割；DNA 聚合酶补平15.核酸水解酶 H; RNA16.质粒 DNA ;病毒 DNA ;质粒和病毒 DNA 杂合体17.复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA 的插入18.正比19,星号（*）活性20.DNA 的纯度、 DNA 的甲基化程度、温度、缓冲液（Buffer）21.416 C22.pBR322 和 M13 ; pMBl ;转座子23.它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；对某些噬菌体（如，噬菌的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽24.没有合适

10、的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记25. 质粒；二噬菌体； 4526.（1）分子量大，（2）酶的多切点，（3）无选择标记27.复制区；IG 区28. 75%105%29.螯合 Mg2+离子，抑制核酸酶的活性30.中和 DNA 分子的负电荷，增加 DNA 分子间的凝聚力31.合成探针；合成 cDNA ; （3）用于 PCR 反应；进行序列分析32. T载体433. 第二链合成时形成的发夹环？34. 乙醇使 DNA 分子脱水35.（1）保持正确的可读框（2）能够使其转录的启动子（3）具有翻译的起始和终止信号36. 接受外源 DNA 的生理状态37.（1）黏性末端连接；（2）平末端连接；（3）同聚

11、物接尾连接；（4）接头连接法38.基因组 DNA 克隆； 基因组 DNA 文库39. cDNA 克隆；cDNA 文库40. 聚合酶链式反应（PCR）41. 0 C； 42 C42.（1）遗传学方法；物理筛选法；核酸杂交法；表达产物分析法43. 插入外源片段的种类较多，大小又极为相似的重组体的筛选44. 基因组 DNA ； cDNA45.53或 3 5方向特异地水解 RNA-DNA 杂交双链中的 RNA 链46. pSC10147. 辅助噬菌体48.（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比 DNA 文库小的多，容易构建49. CaCb50. S

12、outhern 印迹51. 53合成酶；3、5 外切核酸酶552 (1)克隆的是完整的基因； (2)使用的是表达载体； (3)不含内含子53 (1)印迹的对象不同： Northern 是 RNA ，Southern 是 DNA ；(2)电泳条件不同，前者是变 性条件，后者是非变性条件54叶盘法、电击法、基因枪法二、选择题 (单选或多选 )1 因研究重组 DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是 ( )(a)A Kornberg (b)W Gilbert (c)P Berg (d)B McClintock2 第一个作为重组 DNA 载体的质粒是 ( )(a)pBR322 (b)ColEl (c)pS

13、Cl01 (d)pUCl83 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有 ()不太恰当。(a) 由作用于同一 DNA 序列的两种酶构成(b) 这一系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶(c) 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰(d) 不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统4.n型限制性内切核酸酶：()(a) 有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b) 仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c) 限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e) 仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供5.下面有关限制酶的叙述哪些是正确的

14、 ?()(a) 限制酶是外切酶而不是内切酶(b) 限制酶在特异序列(识别位点)对 DNA 进行切割(c) 同一种限制酶切割 DNA 时留下的末端序列总是相同的(d) 一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端(e) 些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端6第一个被分离的n类酶是：()(a)EcoK (b)Hind 川(c)Hindn(d)EcoB7.在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制那一项最好 ?()端 (e) 以上都不是11.可识别并切割特异 DNA 序列的酶是()(e) DNA 酶12.克隆所依赖的 DNA 载体的最基本性质是()(a)反应时间(

15、b)酶量8. 在下列试剂中，那一种可以螯合(a)EDTA (b)柠檬酸钠9. 在下列工具酶中，那一种可以被(c)反应体积(d)酶反应的温度Ca2+离子?()(c)SDS (d)EGTAEGTA 抑制活性 ?()(a)S1 单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31 核酸酶(a)5 磷酸基和 3 羟基基团的末端(b)5 磷酸基和 3 磷酸基团的末端(c) 5羟基和 3羟基基团的末端(d)3 磷酸基和 5羟基基团的末(a) 非限制性核酸外切酶(b)限制性核酸内切酶(c) 限制性核酸外切酶(d)非限制性核酸内切酶(a) 卡那霉素抗性(b)青霉素抗性6(c)自我复制能力(d)自我表达

16、能力(e)自我转录能力13.下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大？()(a)质粒(b) 黏粒(c)酵母人工染色体(YAC) (d) . 噬菌体(e) cDNA 表达载体14. 关于 cDNA 的最正确的说法是：()(a)同 mRNA 互补的单链 DNA (b)同 mRNA 互补的双链 DNA (c).以 mRNA 为模 板合成的双链 DNA(d)以上都正确15.关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确？()(a)功具有可诱导性(b)细菌生长的任何时期都可以出现(c)具有可转移性(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的16. Southem 印迹的 DNA 探针()杂交。(a)只与完全

17、相同的片段(b)可与任何含有相同序列的 DNA 片段(c)可与任何含有互补序列的 DNA 片段(d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA 片段(e).以上都是17.在利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中，IPTG 的作用是()(a)诱导宿主的a肽的合成(b)诱导宿主的3肽的合成(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂18用免疫化学法筛选重组体的原理是19.在基因工程中，DNAt 组体是指(a)根据外源基因的表达(b) 根据载体基因的表达(c)根据 mRNA 同 DNA 的杂交(d)根据 DNA同 DNA 的杂交7(a)不同来源的两段 DNA 单链的复性(b)目的基因与载体的连接物(

18、c)不同来源的(d)原核DN与真核DNA勺连接物(e)两个不同的结构基因形成的连接物20.重组 DNA 的筛选与鉴定不包括哪一方法(a)限制酶酶切图谱鉴定(b) . PCR 扩增鉴定(c)显微注射(d)蓝白筛选(e)抗药筛选21.下面关于多克隆位点(multiple clo ne site, MCS)的描述，不正确的一句是()(a)仅位于质粒载体中(b)具有多种酶的识别序列(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d) 一般是人工合成后添加到载体中22.在 cDNA 技术中，所形成的发夹环可用()(a)限制性内切核酸酶切除(b)用 31 外切核酸酶切除(c)用 S1 核酸酶切除8(d) 用 51 外切

19、核酸酶切除23. 下列对逆转录酶描述正确的是：( )(a) 依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶或称为 RNA 指导的 DNA 聚合酶(b) 依赖于 cDNA 的 DNA 聚合酶或称为 cDNA 指导的 DNA 聚合酶(c) 依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶或称为 DNA 指导的 DNA 聚合酶(d) 依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶或称为 rNA 指导的 RNA 聚合酶24. T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键 基团是( )(a) 2 -OH 和 5-(b) 2 -OH 和 3 -P (c) 3 -OH 和 2 -P (d) 3 -OH

20、 和 5 -P25. 下列哪一种酶作用时需要引物 ? ( )(a) 限制酶 (b) 末端转移酶 (c) 反转录酶 (d) DNA 连接酶26. 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。(a)Southem 印迹杂交(b) Northem 印迹杂交(c)Western 印迹(d) 原位菌落杂交27. Klenow 酶与 DNA 聚合酶相比， 前者丧失了()的活性。(a)5， -3 ，合成酶，(b) 3， -5，外切酶(c) 5， -3，外切酶(d) 转移酶28. 在下列进行 DNA 部分酶切的条件中，控制那一项最好 ? ( )(a) 反应时间 (b) 酶量 (c) 反应体积

21、 (d) 酶反应的温度29. 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )(a) 产生新切点 (b) 易于回收外源片段 (c) 载体不易环化 (d) 影响外源基 因的表达30能够用来克隆 32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是 ()(a)charomid (b)plasmid (C)cosmid (d)phagemid31第一个作为重组 DNA 载体的质粒是 ()(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl832. Ti 质粒：()(a)可从农杆菌转到植物细胞中(b)作为双链 DNA 被转移(c)在植物中导致肿瘤(d)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素

22、(e)需要细菌的 vir 基因帮助转移(f)在植物细胞中作为染色体外质粒33.黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，()(a)它具有 COS 位点，因而可进行体外包装(b)它具有质粒 DNA 的复制特性(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应34.有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Glbert) 和酶学序列分析法(Sa nger)。酶学测序法的基本原理/优点是：()(a) 碱基与特殊染料间不同的相互作用(b) 一个合成引物的延伸和DNA 修复合成的可靠终止(c) 限制性位点与 DNA 末端标记的相关性(d) 可同时对 DNA 双

23、螺旋的两条链进行测序(e) 反应是 DNA 特异的，RNA 不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。35. 关于 cDNA 的最正确的说法是： ()(a)同 mRNA 互补的单链 DNA (b)同 mRNA 互补的双链 DNA(c)以 mRNA 为模板合成的双链 DNA(d)以上都正确36. 用碱法分离质粒 DNA 时，染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为： ()(a)染色体 DNA 断成了碎片(b)染色体 DNA 分子量大，而不能释放(c)染色体变性后来不及复性(d)染色体未同蛋白质分开而沉淀37. 关于碱解法分离质粒 DNA，下面哪一种说法不正确 ?()(a)溶液 I 的作用是

24、悬浮菌体(b)溶液H的作用是使 DNA 变性(c)溶液川的作用是使 DNA 复性9(d)质粒 DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性Clark 做了一个有趣的实验，发现 TaqDNA 聚合酶可以不需要模板，在双链 DNA 的 末端加一个碱基，主要是加 ( ) (a)dGTP (b)dATP (c)dCTP (d)dTTP 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、 cDNA 文库等。在下列文库中，()属 cDNA 文库(a) YAC 文库 (b) MAC 文库 (c) 扣减文库 (d) BAC 文库 下面关于多克隆位点 (multiple clonesite,MCS) 的描述，不

25、正确的句是 ()(a)仅位于质粒载体中(b)具有多种酶的识别序列(c)不同酶的识别序列可以有重叠(d)般是人工合成后添加到载体中在 cDNA 技术中，所形成的发夹环可用 ()(a)限制性内切核酸酶切除(b)用 31 外切核酸酶切除(c)用 S1 核酸酶切除(d)用 51 外切核酸酶切除在 DNA 的酶切反应系统中，通常： ()(a)用 SSC 缓冲液(b)加入 Mg2+作辅助因子(c)加入 BSA 等保护剂(d)上述说法中，有两项是正确的黏性末端连接法，不仅操作方便，而且 ()(a)产生新切点(b)易于回收外源片段(c)载体不易环化在下列表型中， ()是基因工程上理想的受体菌表型+ + * -

26、 - - - - + + + -(a)r m rec (b)r m rec (C)r mrec (d)r m rec 关于 DNA 接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确(a)给外源 DNA 添加适当的切点(b)人工构建载体(c)调整外源基因的可读框(d)增加调控元件cDNA 文库包括该种生物的 ()(a)某些蛋白质的结构基因(b)所有蛋白质的结构基因(c)所有结构基因(d)内含子和调控区下列关于建立 cDNA 文库的叙述中，哪一项是错误的 ?(a) 从特定组织或细胞中提取 DNA 或 RNA(b) 用反转录酶合成 mRNA 的对应单链 DNA(c) 以新合成的单链 DNA 为模板合成

27、双链 DNA(d) 新合成的双链 DNA 甲基化下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的?(a)操作方便(b)易于回收片段(c)易于定向重组(d)载体易于自身环化，降低重组率关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?(功具有可诱导性(b)具有可转移性面关于用 T4 多核苷酸激酶标记 5 端制备探针的描述中 ()是不正确的。(a)既能标记 DNA，又能标记 RNA(b)既能标记双链 DNA 又能标记单链 DNA(c) 只能标记突出的 5端不能标记其他类型末端(d) DNA 或 RNA 必须有 5-OH 的存在(d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA 片段(e)以上都是用下列方法进

28、行重组体的筛选，只有 ()说明外源基因进行了表达。38.394041424344454647484950515253(d)影响外源基因的表达?( )(c)细菌生长的任何时期都可以出现(d )不同细菌出现感受态的比例是不同的Southem 印迹的 DNA 探针 (a)只与完全相同的片段(c)可与任何含有互补序列的)杂交。(b) 可与任何含有相同序列的 DNA 片段DNA 片段10(a)Southem 印迹杂交(b)Northem 印迹杂交(c)Western 印迹(d)原位菌落杂交列哪一个不是 Southern 印迹法的步骤 ?()(a)用限制酶消化 DNADNA 与载体的连接(c)用凝胶电泳分

29、离 DNA 片段(d)DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上11(e)用一个标记的探针与膜杂交54 报告基因 ( )(a) 以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列(b) 以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区(c) 能用于检测启动子的活性(d)能用于确定启动子何时何处有活性55 在利用 lacZ 失活的显色反应筛选法中， IPTG 的作用是 ()(a)诱导宿主的a肽的合成(b)诱导宿主的3肽的合成(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂56. 切口移位是指在 ()作用下，使 ()带上放射性标记。(a)DNA 聚合酶 I，RNA(b)DNA 聚合酶 I， DNA(c)DNA 聚

30、合酶川，RNA (d)DNA 聚合酶川，DNA57用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的()60随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?()(a)双链 DNA、单链 DNA、RNA 都是可以标记的(b)不需要用 Dnase I 预处理(c)反应时可用 Klenow 酶(d)反应时可用 DNA 聚合酶 161在切口移位标记 DNA 探针时只能使用 ()(a)Klenow 酶(b)DNA 聚合酶 I(c)DNA 聚合酶n62要对一双链的 DNA 分子进行 31 末端标记，可用 ()(a)Klenow 酶(b)DNA 聚合酶 I(c)T4DNA 聚合酶答案1 . c； 2. c； 3 . b

31、； 4.b5. b，c，d， e； 6. c； 7. b；8. d；9. d；10. a； 11 . b；12. c；13 . c； 14. c15. b；16. c；17.a；18. a；19. b；20. c；21 . a；22.c； 23 . a；24. d；25. c；26. c；27.c； 28. a；29.b；30. a； 31 . c； 32. a,c,d,e，33. a， b，c；34. b； 35. c；36. c； 37 . d； 38. b； 39. c；40. a； 41. c； 42. a， b， c； 43. b；44. b；45. d； 46. a； 47. a；

32、48. c；49. c；50. b；51 . c； 52. c； 53. b；54.a,c,d；55. a；56. b ；57. a，b； 58. c； 59. a； 60. d；61. b； 62. c；三、简答题1说明 Sanger DNA 测序法的原理。2某学生在用 EcoRI 切割外源 DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因 ?3.在序列 5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个 6bp 的n类限制性内切核酸酶的识别序列, 该位点的序列可能是什么 ?4下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是n类酶的识别序列：GAATCG， AAATTT ， GATATC， ACGG

33、CA? 为什么 ?5.当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施 为什么 ?6.套嵌引物7. 同尾酶8. 载体9.质粒10.穿梭质粒载体(a)DNA (b)RNA (c)抗体58 Southern 印迹是用 DNA 探针检测(a)用 RNA 探针检测 DNA 片段(c)用 DNA 探针检测 RNA 片段59用免疫化学法筛选重组体的原理是(a)根据外源基因的表达(c)根据 mRNA 同 DNA 的杂交(d)抗原DNA 片段，而 Northern 印迹则是： ()(b) 用 RNA 探针检测 RNA 片段(d) 用 DNA 探针检测蛋白质片段( )(b)根据载体基因的表

34、达(d)根据 DNA 同 DNA 的杂交(d)DNA 聚合酶川(d)T7DNA 聚合酶1211目的基因12文库的查询13免疫化学检测法14无细胞翻译系统15柯斯克隆16 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。17 酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构 ?18 何谓 YAC? 主要特性是什么 ?19 Muller 的 PCR 反应同大肠杆菌体内的 DNA 复制有哪些不同 ?你认为根本的差别在 哪里?20欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如 Ecoli) 中进行表达，克隆时应注意哪些问题 ?21假定你分离到一个 Ecoli 的 Thy-突变体，并推测有可能是 Thy

35、A 基因突变。请设计 一个方案用PCR 从染色体 DNA 扩增突变的 ThyA 基因，测定突变的序列。(注：E. coli 野生型的 ThyA 基因的序列是已知的 )22.你在做 Southern 印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤 是用 NaOH溶液浸泡凝胶，使 DNA 变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步， 直接将 DNA 从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自 显影片是空白。错在哪里 ?23. 切口移位 (nick translation) 标记探针的主要步骤有哪些 ?24.用 EcoRI 和 Hind 川分别切割同一来源的染色体DNA，

36、并进行克隆，在前者的克隆 中筛选到A 基因，但在后者的克隆中未筛选到 A 基因，请说明原因。25. 什么是 Western 印迹 ?它与 Southern 印迹有什么不同 ?26.用一限制性内切核酸酶切割Lac+Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4 个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac 基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA 聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac-Tets受体菌，筛选 Tetr转化子，问：Lac 的基因型是什么？并说明原因。27.在基因工程中，为了在细菌细胞

37、中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA 而不用基因组 DNA? 为什么要在 cDNA 前加上细菌的启动子 ?答案1.答：Sanger DNA 测序法是建立在两个基本原理之上： (1)核酸是依赖于模板在聚合酶的 作用下由 5端向 3端聚合 (DNA 聚合酶参与了细菌修复 DNA 合成过程 )；(2)可延 伸的引物必须能提供游离的 3羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的 3羟基末 端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用 4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获 得 4 组长度不同的 DNA 片段。通过比较所有 DNA 片段的长度可以得知核苷酸的 序列。2.答： 盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓

38、度过高。3.答：回文序列是： 5-CATATG-3 ，4.答：GATATC；AAATTT ，因为它们是回文序列。5. 答： 注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一 种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。6.答： 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。7.答：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。& 答：在基因工程操作中，把能携带外源DNA 进入受体细胞的 DNA 分子叫载体。139.答：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA 分子。10. 答：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标

39、记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的质粒载体。11. 答：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。12.答：用目的基因探针与文库中的重组载体进行杂交。13. 答:利用抗体作为 探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。14答:能把外源的 mRNA 翻译成蛋白质的细胞提取物。女口：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。15答:应用 cosmid 载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA 技术，叫 柯斯克隆”(cosmid cloning )。16.答:(1)COS 位点可以自身环化；(2)可以利用 COS 位点包装噬菌体颗粒；可以感染寄主细胞；利用质粒复制子复制，不整合、不

40、裂解。17答：(1)着丝粒；端粒； (3)ARS 序列。18. 答:(1) 含有来自其他生物 DNA 的酵母人工染色体，叫 YAC ；(2) 主要特性是可以克隆较大的外源片段。19. 答:PCR 用双引物，体内复制用单引物。20. 答：应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。21. 答:为了扩增突变体的 thyA 基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA 基因的 5端相同，另一个引物同该基因的3端互补。在引物的 5端加上合适H类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA 同引物混合后，进行 PCR 扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到

41、合适的载体再测序。22. 答:如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。23. 答:(1) DNasel 造成切口；(2) DNA 聚合酶 III 的 5、3外切核酸酶进行切割；(3) DNA 聚合酶川的 5、3 合成酶进行修补；在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA 中。24. 答：原因是：Hind 川的切点在 A 基因内。25答:Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗 体进行检测。它与 Southern 的不同在于探针的性质不同，在 Western 印迹中

42、使用的探针是抗体(蛋白质)。1426.答:基因型是 lac .原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以 因是缺陷的。27答:这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。四、问答题：1.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。2.什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素影向？3.影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有哪些？4.什么是 Klenow 酶?有哪些活性？在基因工程中有什么作用？5细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同？在基因工程中有什么用途？6.入外切核酸酶(lambda exo nuclease)基本活性是什么？在基因工程中有什么应用？7

43、.Mn2+、Mg2+对 Dnase l(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响？Dnase I 在基因工程中有什么作用？&质粒如何维持在细胞中的稳定？9由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行 严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几 个方面？10.为什么野生型的噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体？11.碱裂解法提取质粒 DNADNA 勺原理？12什么是 PCRPCR 反应及其特点13.PCFPCF 反应设计引物的原则：14.实现 DNADNA 局部消化的措施有几种？15.简述末端脱氧核苷酸转移酶、T4

44、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、S1S1 核酸酶的 功能及主要用途？16.基因工程对载体的要求17.简述蓝白斑筛选的原理18.简述基因组文库和 cDNAcDNA 文库构建过程19.试述转化、转染、转导的区别？20.酶联免疫吸附测定(ELISAELISA)原理21.什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾？具有哪些优 缺点？22.何谓接头连接法 (1i nker ligatio n)?23.什么是同裂酶？为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高？24.为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生

45、物中表达，你如何确保最终能得到产物？25.某一质粒载体具有Tetr和 Kanr的表型，在 Kan 抗性基因内有一 Bgl I 的切点。现用Bgl I 切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素？(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?26.以 pBR322 DNA 作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA 时，可采用环丝氨 酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。27.放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么？28.什么是随机引物(random primer)

46、?如何标记 DNA?29.什么是印迹(blotting)杂交？Lac 的基1530.什么是原位菌落杂交(colony hybridization)?31说明 Southern 杂交的原理和方法。32 Northern 印迹与 Southern 印迹有什么不同 ? 33建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?答案：1 答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名 +株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3-4 个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的

47、第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定， 但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I 、n、川、等，用正体。2 答：n类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限 制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松 动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因 条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星 活性。概括起来，诱发星活性的因素有如下

48、几种：高甘油含量(5 %, v/ v)；限制性内切核酸酶用量过高(100U / ugDNA) ; (3)低离子强度(1000对照 3省去磷酸酶处理，无 cDNATMTC0435对照 4无 cDNATMTC025实验样品TMTC034注：TMTC=too many to count，多到无法计数。4.打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化，决定将一段6 个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N 端或 C 端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被 EDTA 或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。图 22. 9 是编码该蛋白的

49、核苷酸序列。请设计一对 PCR 引物，各含有 18 个同该基因同 源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N 端有一个起始密码，其后是 6 个组氨酸密码子。另外设计一对引物，能够在C 端加上 6 个组氨酸和一个终止密码。22LRDPQGGVI5 -CTTAGAGACCCGCAGGGCGGCGTCATC- 3N 末端MATRRAA5 -GGT CGT ATG GCT ACT CGT CGC GCT GCTCTT GCT GCA AGT CTC TCT TAG AAG TGT- 3LA ASLSC 末端答案1答：要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：(1) 细菌的

50、RNA 聚合酶不能识别真核生物的启动子。(2) 大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA 中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。(3) 有些真核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的 33 个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的链。产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：1应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG 的细菌强启动子的附近(含有这种序列的载体称表达载体)。2可以以激素的 mRNA 为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA 不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码 ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的