《腺病毒病原菌调查和防治》研究报告

1、燕京理工学院2016届微生物学大作业燕京理工学院Yanching Institute of Technology（2016）届本科生微生物大作业题目： 腺病毒病原菌调查和防治研究报告 学院： 化工与材料工程学院 专业： 化工与制药 学号： xxxxxxxxx 姓名： Dream 指导教师： 刘雪凌 教研室主任（负责人）： 林贝 2015 年 6 月 27 日腺病毒原菌的调查和防治研究报告Dream化工与制药专业 化药1204班 学号xxxxxxx指导老师 刘雪玲老师 摘 要本研究题为学校内小卖铺食品包装上的病原菌调查和防治。首先对小卖铺的食品包装进行采样、接种、培养对病原菌种类筛分并且选其一种

2、病毒病原菌进行培养研究。在根据所选病毒进行培养基的制备并对所选病毒进行实验设计，鉴别出具体病毒；了解该病毒结构及分类，以及病毒的侵染繁殖的过程，根据研究的病原菌设计如何防治、杀毒等问题进行讨论，最后叙述人感染这一病毒如何治疗。关键词： 病毒 培养基 防治第 1 页 共 36 页目 录第一章 课题研究背景与价值61.1 选题的意义与价值61.1.1理论意义与价值61.1.2实践意义与价值61.2 研究视角与方法61.2.1 研究视角61.2.2 研究方法6第二章 培养基的制备82.1 微生物的营养82.1.1 碳源与氮源82.1.2 能源82.1.3 生长因子92.1.4 无机盐92.2 微生物

3、培养基的类型102.2.1 按照培养基的物理状态分112.2.2 按照微生物的种类分112.2.3 按照培养基用途分122.3 培养基的制备实验方案12第三章 微生物的采样、分装与细菌的接种143.1 采样153.2 分装与细菌的接种实验15第四章 病原菌的显微镜观察鉴定174.1 微生物的鉴别方法184.1.1 传统法184.1.2 微生物鉴别方法新技术新方法184.1.2.1 细胞壁组分分析184.1.2.2 红外光谱IR184.1.2.3 气相色谱GC184.1.2.4 高效液相色谱HPLC184.1.2.5 质谱分析MS184.1.3 微生物鉴别方法分子生物学方法184.1.3.1 D

4、NA碱基比184.1.3.2 核酸的分子杂交184.2 微生物的分类194.3 腺病毒的显微镜鉴别实验194.4 显微镜的使用204.4.1 显微镜的操作20第五章 腺病毒的形态描述及生长繁殖215.1 病毒的介绍215.1.1 腺病毒的定义225.1.2 腺病毒的构成225.1.3 腺病毒的分类235.2 腺病毒诱发的疾病245.2.1 呼吸道感染245.2.2 眼部感染255.2.3 胃肠炎255.2.4 其他疾患255.2.5 腺病毒感染后可获得对同型的持久免疫力255.3 腺病毒的防止原则25第六章 微生物制药的研究进展266.1 研究内容276.1.1 微生物生产维生素276.1.2

5、 微生物生产多价不饱和脂肪酸286.1.3 微生物生产抗生素296.1.5 微生物生产医用酶制剂30The adenovirus bacteria investigation and prevention studyAbstractThis study grocery stories titled school pathogen investigation and prevention and control of food packaging. The food packaging samples of grocery stories, vaccination, cultivation of

6、 pathogenic bacteria screening and choose kinds of virus pathogens for culture study. In the preparation of culture medium according to the selected virus and carries on the design of experiment for the selected virus, identify the specific virus; Know the structure of the virus and classification,

7、and virus infection of the reproductive process, according to the design of the pathogen discussed such problems as how to control, anti-virus, finally describes how people are infected with this virus.Keywords: virus medium prophylaxis and treatment前 言根据研究学校小卖铺视频包装上的病原菌。本论文通过制备培养基、采样、接种、纯培养的方法对病毒进行

8、培育，并对病毒设计出简单的实验方案且进行研究。通过研究确定出该病毒，并介绍了该病原菌的形态结构及生长繁殖、分类及生活史。病毒是颗粒很小、以纳米为测量单位、结构简单、寄生性严格，以复制进行繁殖的一类非细胞型微生物。病毒是比细菌还小、没有细胞结构、只能在细胞中增殖的微生物。由蛋白质和核酸组成。多数要用电子显微镜才能观察到。病毒，是一类不具细胞结构，具有遗传、复制等生命特征的微生物。一般为球状、杆状、蝌蚪状。病毒同所有的生物一样，具有遗传、变异、进化的能力，是一种体积非常微小，结构极其简单的生命形式，病毒有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量，离开宿主细胞，它

9、只是一个大化学分子，停止活动，可制成蛋白质结晶，为一个非生命体，遇到宿主细胞它会通过吸附、进入、复制、装配、释放子代病毒而显示典型的生命体特征，所以病毒是介于生物与非生物的一种原始的生命体。通过研究的病毒讨论如何防治？人类如果感染如何治疗？是否通过病毒的研究研制出被该病毒感染的药等等。第一章 课题研究背景与价值1.1 选题的意义与价值1.1.1理论意义与价值病毒是一种只能在活体细胞中进行复制的微小感染源。尽管病毒种类成千上万，但自从马丁努斯拜林克（Martinus Beijerinck）于1898年首次发现烟草花叶病病毒以来，人类有明确认识的病毒大约仅有5000种。多数病毒特别小，是普通细菌大

10、小的百分之一，用光学显微镜无法观察到。病毒能使各种生物体受到感染，如动植物、细菌和古生菌都可能受到病毒侵扰。1.1.2实践意义与价值病毒对宿主细胞的影响有一定的范围，这个范围开始时可能很小，但当病毒能够影响更多物种时，这个范围就扩大了。病毒是一种非细胞生命形态，它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。一旦进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。1.2 研究视角与方法1.2.1 研究视角一般来说，病

11、毒感染是通过蛋白质外壳将RNA或DNA注射进生物体细胞中，之后细胞开始对这些RNA或DNA进行解码，从而进入细胞蛋白质中，进而使生物体感染疾病。当然，这也取决于病毒本身的性质，因为不同病毒的感染方式也是不同的。1.2.2 研究方法首先对该养殖场里鸡的粪便进行采样、接种、培养对病原菌种类筛分并且选其一种病毒病原菌进行培养研究。在根据所选病毒进行培养基的制备并对所选病毒进行实验设计，鉴别出具体病毒提出设计防治方案。第二章 培养基的制备2.1 微生物的营养分析微生物细胞的化学组成，可以大致了解微生物需要的营养物质。微生物的化学组成与其他生物的大体相同，也是由C、H、O、N、P、S以及其它元素组成，其

12、中C、H、O、N占细胞干重的90以上。组成微生物的化学元素分别来自微生物生长所需的营养物质，营养物质按照它们在机体中的生理作用，将它们区分为碳源、氮源、能源、生长因子、水和无机盐六大类。各类营养物质都有一定的功能，不同代谢类型的生物所需营养物质、类型不同。2.1.1 碳源与氮源概念来源最常用来源作用说明碳源凡能为微生物提供所需碳元素的营养物质无机碳源：CO2、HaHCO3等有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类尤其是葡萄糖主要是用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物不同种类的微生物，对碳源需要差别大，例：甲基营养菌：只利用甲醇、甲烷假单孢菌：利用90多种含碳化合物氮源凡能为微生物提供所需

13、氮元素的营养物质无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等铵盐、硝酸盐主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物异养微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源2.1.2 能源能源(energy source)即是能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。异养微生物的能源就是其碳源，因此，微生物的能源就显得十分简单：化能自养微生物的能源物质都是一些还原态的无机物质。如硝酸细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。由于这类独特的化能自养营养类型在微生物中的存在，说明生物界的能源并非像过去普遍认为的只是直接或间接利用太阳能这一方式。一

14、种营养物通常有一种以上营养要素功能的例子，还原态无机养料常具有双功能AA111(如NH?既是硝酸细菌的能源，又是其碳源)甚至还有三功能的(能源、碳源、氮源)营养物；有机物常有双功能或三功能，如“N·CH·O”类营养物常是异养微生物的能源、碳源兼氮源。2.1.3 生长因子生长因子(growth factor)是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自己合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外，还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4-C6 的分枝或直链脂肪酸，以及需要量较大的氨基酸；狭义的生长因子一般仅指维生素。 生长因子虽是重要的营养素

15、，但它与碳源、氮源和能源不同，并非任何一种微生物都需从外界吸收。各种微生物与生长因子的关系可分为以下几类：(1)生长因子自养型微生物(auxoautotroths)。多数真菌、放线菌、和不少细菌，如大肠杆菌(Ecoli)等都是不需要外界提供生长因子的生长因子自养型微生物。(2)生长因子异养型微生物(auxoheterotrophs)。它们需要多种生长因子，如乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等(表5-5)。如乳酸菌生长需多种维生素；许多微生物及其营养缺陷型(突变株)都需要不同的嘌呤、嘧啶碱基；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)需要卟啉及其衍生物作为其生长因子；

16、支原体常需要甾醇；副溶血嗜血菌(Haemophilusparahaernolyticus)需要胺类；一些瘤胃微生物需要C4-C6分或直链脂肪酸；某些厌氧菌如产黑素拟杆菌需要维生素和氯高铁血红素等。(3) 生长因子过量合成的微生物。有些微生物在其代谢活动中，会合成出大量的维生素及其他生长因子，因此，它们可以作为维生素等的生产菌。最突出的是生产维生素的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbya)，其B2产量可达2.5g/L发酵液，棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)也生产维生素AA112B?，谢氏丙酸菌(Proonibacterium shermanii)生产维生素B12。2.1

17、.4 无机盐无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物。它们为机体提供必需的金属元素。这些金属元素在机体中的生理作用：参与酶的组成、调节酶的活性、维持细胞结构的稳定性、调节与维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等。一般微生物生长所需要的无机盐浓度在AA11310?10?mol·L?范围内的，可称为常量元素，例如磷、硫、钾、镁、钙、钠和铁等。凡所需浓度在AA11310?10?mol·L?范围内的，称为微量元素，如铜、锌、锰、钼和钴等。这种区分带有人为的和相对的性质，对不同的微生物来说，常会有较大的差别。2.1.5 水 除了少数微生物如蓝细菌能

18、利用水中的氢作为还原二氧化碳时的还原剂外，其他微生物都不能利用水作为营养物，但它在微生物的代谢中起着重要作用。水的生理功能：水是微生物细胞的重要组成成分，占活细胞总量的90左右；机体内的一系列生理生化反应都离不开水；营养物质的吸收与代谢产物的分泌都是通过水来完成的；水的比热高，又是热的良好导体，因而能有效地吸收代谢过程中放出的热，并迅速地散发出去，避免细胞内温度突然升高，故能有效地控制温度的变化。2.2 微生物培养基的类型1、按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。2、按照培养基的物理状态分 培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固

19、体培养基三类。3、按照微生物的种类分 培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类4.按照培养基用途分 培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。（1）合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。（2）天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，所以常被采

20、用。（3）半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。合成培养基天然培养基主要成分准确测量的化学试剂加蒸馏水化学成分不明确的天然物质优点化学成分明确，精确定量，可重复性强配制方便，营养丰富，原料易得，培养效果好缺点配制繁琐，成本较高，培养效果一般成分不明确，实验重复性差应用用于微生物的分类，鉴定，研究一般用于工业生产2.2.1 按照培养基的物理状态分培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。（1）固体培养基。是在培养基中加入凝固

21、剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。用于微生物分离，鉴定，计数。如图，微生物分离成菌落、菌苔。图中为大肠杆菌菌落，是用徒步平板得到。（2）半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固剂状态。可用于观察菌落的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。用于观察微生物运动特征。如图，左侧试管中微生物不运动，而右侧试管中微生物运动，因而两试管中现象不同。（3） 液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。2.2.2 按照微生物的种类分培

22、养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。（1）常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基。（2）常用的放线菌培养基为高氏1号培养基。（3）常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基。（4）常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁蔗糖（或葡萄糖，葡萄糖比较昂贵）琼脂培养基和察氏培养基等。2.2.3 按照培养基用途分培养基按其特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。（1）基础培养基。是含有一般微生物生长繁殖所需的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的 基础培养基。（2）加富培养基。是在基础培养基中加入血、血清、动植物组织提取

23、液制成的培养基。用于培养要求比较苛刻的某些微生物。（3）选择性培养基。是在普通培养基中加入特殊营养物质或化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。（4）鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。如鉴别大肠杆菌的伊红美蓝培养基，鉴别纤维素分解菌的刚果红培养基。2.3 培养基的制备实验方案一、实验目的1、使病毒存活2、熟练掌握培养基制备二、实验原理由于病毒不能在一般的培养皿中进行培养，只能做活体实验或者是用细菌培养基进行培养，所以本实验采用培养细菌的方法进行培养该病毒。初

24、步选定为培养大肠杆菌，则该细菌充当了本实验中星状病毒的宿主细胞，在培养到一定阶段后，通过让病毒侵染大肠杆菌，使得病毒在其体内进行生活繁殖，从而保证了它的存活性。 大肠杆菌培养基为常见的培养基，以下为培养基的配方设计及操作步骤大肠杆菌培养基的配方： LB Medium (LB 培养基) Yeast extact (酵母膏) 5g Peptone (蛋白胨) 10g NaCl 10g Agar (琼脂) 1-2% Distilled water (蒸馏水) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠埃希氏菌（大肠杆菌） 三、实验器材1、大肠杆菌培养基配制方法（1）称量：按培养基配方比例依次推确地称

25、取酵母膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。（2）溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。(3)调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，

26、用mol/LHCL进行调节， 对于有些要求pH较精确的微生物pH的调节可用酸度计进行。(4)过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。(5)分装按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。 液体分装：分装高度以试管高度的l/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧

27、瓶容积的一半为宜。半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。(6)加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。（7)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明

28、培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。(8)灭菌 将上述培养基以0.103MPa，121，20min高压蒸气灭菌。(9)搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右以防斜面上冷凝水太多，将试管口端捆在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 。(10)无菌捡查将灭菌培养基放人37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。第三章 微生物的采样、分装与细菌的接种3.1 采样直接带上灭菌手套，到养殖产鸡圈抓到鸡后用等着它拉便便然后置于封口袋内，04摄氏度保存，用于测微生物含量

29、。3.2 分装与细菌的接种实验一、实验目的1掌握液体、半固体、固体培养基的分装；2掌握细菌在液体、半固体、固体培养基上的接种。二、实验物品接种环，接种针，酒精灯，试管架，无菌试管，无菌平板，菌种等三、实验内容培养基的分装所有物品均应在使用前严格进行灭菌，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触.固体培养基的分装：将灭菌的培养基熔化后冷却约至50，以无菌操作倾注于灭菌平板内，自然愈合，水平旋转，待冷凝固后翻转。注意：倾注平板时切勿将皿盖完全开启，以免细菌落入。新制的平板水分较多，不利于细菌的分离，可将平板倒扣3730分钟使其表面干燥。2.液体、半固体培养基的分装：先开试管塞（小塞）再开三角烧瓶塞子（

30、大塞），瓶口（管口）通过火焰2-3次，分装量为试管容量的1/3。半固体培养基要趁热直放。注意：无菌试管和烧瓶，于开塞后及盖塞之前，口部应通过火焰3次，以杀死可能附着管口或瓶口的细菌。开塞后的管口及瓶口应尽量靠近火焰，试管及烧瓶应尽量平放，切忌口部向上和长时间暴露于空气中。细菌的接种与分离方法基本程序：灭菌接种环/针待冷沾取细菌进行接种灭菌接种环/针接种环和接种针是接种细菌的必备工具，由镍锘合金或白金丝制成，接种环直径约2-4mm，一个合格的接种环是正圆形，连接端没有空隙，接种针长约50-80mm。两端连接有一绝缘体的金属棒。接种针与接种环在使用前要在酒精灯的火焰上灭菌后使用接种环固体培养基和液

31、体培养基的接种接种针 半固体培养基的接种接种与分离技术根据标本的来源，培养目的及所用培养近的种类，采用不同的接种方法平板划线法对于混有多种细菌的临床标本或其他培养物，经过划线接种到固体培养基表面，划线起到分散作用，一般经18-24小时培养后可得到单个菌落，供细菌计数和纯培养用（挑选单个菌落，转移至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养），分离纯培养是从临床标本中检查鉴定细菌非常重要的第一步，只有先从含有多种杂菌的标本中分离出目的菌纯培养，才能进一步对目的菌予以鉴定和研究（曲线划线法）此法多用于含细菌量不多的标本或咽拭，棉拭等标本的细菌分离培养方法：先将标本或培养物涂于平板1/5处，然

32、后用接种环自标本涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条平行线。平板培养基表面与接种环约呈45°，主要在于手指用力，自如划线。标准：线条密而直，不重复，充分利用平板，两边都要划到，不可划破。分区划线法 此法多用于脓汁,粪便等含菌量较多的标本的分离.其方法是首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分(第一区),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通过第一区3-4次后连续划线(为第二区),依次可共划线3-5区,每一区细菌数可逐渐减少,直到分离出单个菌落为止.。每划1/4转动90度，线和线之间尽量不要重叠。穿刺接种法：主要用于半固体培养基的接种，可观察细菌的动力将

33、取有细菌的接种针于半固体培养基中心处向下垂直穿刺，不要刺到试管底部，刺到距管底约0.3-0.5cm处.沿原路退出。液体接种法：多用于增菌试验，本法多用于普通肉汤,蛋白胨,水等液体培养基的接种.其方法是接种环沾取菌种,倾斜液体培养基管,先在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体能淹没接种物为准), 2-3次，塞好棉塞后轻轻混合即可。注意：接种时避免接种环与液体过多接触，更不应该在液体中搅拌、混匀，以免形成气溶胶，造成实验室污染。 细菌的培养方法 根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法,二氧化碳培养法和厌氧培养法三种下面介绍一般培养法。一般培养法 将已接种过的培养基,置37培

34、养箱内18-24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌,需培养3-7天直至一个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度,可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基,接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固,以防培养基干裂。4、 实验结论本次实验是微生物学检验技术中最基本最重要的操作技能，讲解方法步骤时要详细，要条理清晰，重点要强调姿势和无菌操作。该病毒以存活且无污染可以做鉴别实验。第四章 病原菌的显微镜观察鉴定4.1 微生物的鉴别方法4.1.1 传统法 细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽

35、孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。4.1.2 微生物鉴别方法新技术新方法4.1.2.1 细胞壁组分分析细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中，把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来，有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析，根据细胞壁的氨基酸组成，将其分为6个细胞壁类型，又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型，在此基础上，结合形态特征提出了相应的科属检索表。4.1.2.2 红外光谱IR一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同，可以初步认为它们是同一种物质。因此，红外光谱技术被

36、应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类，近年来又应用于放线菌分类根据有关学者的试验表明，这种方法简便快速，样品少，结果较好，不仅可以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质，同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。4.1.2.3 气相色谱GC4.1.2.4 高效液相色谱HPLC4.1.2.5 质谱分析MS4.1.3 微生物鉴别方法分子生物学方法4.1.3.1 DNA碱基比目前已经测定了大量生物的DNA碱基组成，从中可以发现一些带有规律性的结论：亲缘关系密切而表型又高度相似的微生物应该具有相似的DNA碱基比；不同微生物之间的DNA碱基比差别很大，则表明它们之间亲缘关系

37、疏远。4.1.3.2 核酸的分子杂交前面已经谈到，亲缘关系相近的微生物，其DNA碱基比相同或相近。反之则不然，也就是说，DNA碱基比相同或相近的微生物，其亲缘关系并不一定相近。这是因为DNA碱基比的相同或相近并不反映碱基对的排列顺序相同或相近，而微生物间的亲缘关系主要取决于它们碱基对的排列顺序的相同程度。4.2 微生物的分类微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物 形体微小,结构简单,通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物,统称为微生物。（但有些微生物是可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）分类原核类:三菌,三体.三菌：细菌、蓝细菌、放线菌 三体：支原体、衣原体、立克次氏体 真核类:

38、真菌,原生动物,显微藻类。非细胞类:病毒,亚病毒 ( 类病毒,拟病毒,朊病毒)。4.3 腺病毒的显微镜鉴别实验一、实验目的1学习微生物（细菌）鉴定的原理和方法。2掌握微生物（细菌）的快速鉴定操作步骤与自动化分析技术。3利用所学知识，分析并掌握微生物（细菌）的鉴定思路。4强化生物学知识，提高学生动手操作能力。二、实验原理细菌鉴定是细菌分类学中最实用的部分，与工、农业生产及人类生活有着密切的联系。在动、植物检疫，食品卫生检验，人类及动、植物病原诊断，环境微生物学研究等领域均需要细菌鉴定方面的工作。细菌的鉴定是确定一个新的分离物是否属于一个已被命名的分类单元的过程。主要包括分离培养、显微镜观察、生理

39、生化试验、血清学检验和动、植物接种等环节或技术。此外，还有噬菌体敏感性及抗生素敏感性试验等。3、 实验材料器材：ID32E 接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、接种台、恒温培养箱、ATB Expression仪、移液管、移液枪药剂：生理盐水、培养1824h的接种菌、石蜡油、James 指示剂。四、实验步骤1准备好ID32E接种条、6cm培养皿、接种环、火焰灯、移液管、移液枪、接种菌、石蜡油、生理盐水等用品，放到接种台上，并打开火焰灯。2.用移液管移取5ml的生理盐水加入到6cm培养皿中。3把接种环放到火焰灯上烧红（保证细菌全部烧死），之后在旁边冷却，等温度降至100°左右时放入接种

40、菌试管中的琼脂部分再冷却至常温，之后挑取接种菌，并放到培养皿中涂布均匀。4用移液枪移取培养皿中稀释的细菌液，然后滴在ID32E接种条上的32个孔中（每个孔55微升）。5在接种条上的06号滴一滴石蜡油，保证其孔成厌氧状态。6盖好接种条的盖子，放入37°恒温培养相中培养24小时。注意：要保持湿润。7.24小时后，取出ID32E接种条，在IND孔上加入James 指示剂，并在API验证。4.4 显微镜的使用4.4.1 显微镜的操作1. 右手握住镜臂，左手托住镜座。2把显微镜放在实验台上,略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处）安装好目镜和物镜。3转动转换器,使低倍物镜对准通光孔(物镜的

41、前端与载物台要保持2厘米的距离)。4把一个较大的光圈对准通光孔.左眼注视目镜内(右眼睁开,同时画图)。转动反光镜,使光线通过通光孔反射到镜筒内.通过目镜,可以看到白亮的视野。5把所要观察的玻片标本（也可以用印有“6”字的薄纸片制成）放在载物台上,用压片夹压住,标本要正对通光孔的中心。6转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降,直到物镜接近玻片标本为止（眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。7左眼向目镜内看,同时反方向转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清物像为止.再略微转动细准焦螺旋,使看到的物像更加清晰。注意事项：实验完毕,把显微镜的外表擦拭干净.转动转换器，把两个物镜偏到两旁,并将镜筒缓缓下降到最

42、低处。最后把显微镜放进镜箱里,送回原处。五、实验结果与讨论通过微生物鉴别实验和显微镜观察实验得知这种病毒是腺病毒。第5章 腺病毒的形态描述及生长繁殖5.1 病毒的介绍5.1.1 腺病毒的定义腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为7090nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为79 nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55X103Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。5.1.2 腺病毒的构成腺病毒呈无囊膜的球形结构,其病毒粒子在感染的细胞核内

43、常呈晶格状排列,每个病毒颗粒包含一个36kb的线腺病毒结构示意图性双链DNA,两端各有一个100600 bp的反向末端重复序列(inverted terminal re-pea,tITR), ITR的内侧为病毒包装信号,是病毒包装所需要的顺式作用元件。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1L5基因。线状双股DNA与核心蛋白形成直径为6065 nm的髓芯,被包裹于衣壳内。衣壳呈二十面体对称,由252个直径810 nm的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上,每边6个,其中240个为六邻体(非顶点壳粒) ,另12个为五邻体基底(顶点壳粒)。每个六邻体是六

44、邻体蛋白的同源三聚体,三聚体的六邻体分子有一个三角形的塔尖和五面体的基底,塔区由4个环构成即loop1、loop2、loop3、loop4,基底包含两个区域P1、P2区3。六邻体上的表位(epitope)是诊断不同血清型的标准,它包括哺乳动物腺病毒属的抗原成分,是病毒体对免疫选择压力最敏感的部位。每个五邻体基底上结合着1根(哺乳动物腺病毒)或2根(禽腺病毒)长977. 5 nm的纤维突起,这些纤维以五邻体蛋白为基底由衣壳面伸出,纤维顶端形成头节区,纤突有血清特异性,且含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。腺病毒含13%DNA和87%的蛋白质，病毒体分子量约为175×106。

45、病毒基因组为线状双链DNA，大约含35kb36kb，腺病毒12、18和31型的DNA组成中，G+C mol%最低（48%49%），属于对动物具有高致癌性基因型。腺病毒1、2、4、5、8等型的G+C mol%较高（61%），致癌性反而低或无。这是一种用于人腺病毒分离株的分组的标准，根据其基因同源性将人腺病毒分为AF等6组。腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在，由蛋白VII和一种称为mu的小蛋白紧密地环绕在其周围，起到类组蛋白样的作用。另一种蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来，并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。在两条链的5端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白（pTP）复合物（DNA

46、-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在左端ITR的3侧有一段长约300bp的包装信号（）介导腺病毒基因组包装入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号（）的约0.5kb的序列是顺式作用元件，也就是说必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可以通过辅助病毒（或细胞）反式补足。病毒蛋白约11种（TP和PP），其中有4种蛋白（病毒多肽P、P，末端蛋白TP、酶蛋白P）与病毒基因构成病毒核心，多肽P是主要的核心蛋白，如同组蛋白一样包裹病毒基因DNA。构成病毒衣壳的蛋白质约7种。多肽P是病毒

47、衣壳中最丰富和最主要成分，六邻体是由3个P分子紧密相连组成。多肽P、P在六邻体与病毒核心之间形成连接桥，并与多肽P一起稳定着六邻体分子的晶格排列。5个分子多肽P相连构成五邻体的基座蛋白，Pa为五邻体的周围蛋白，也参与衣壳的组成，五邻体通过P与病毒核心相连。多肽P主要构成病毒三聚体纤突，纤突与病毒血凝活性相关，因血凝素（纤突）具有型特异性，常用血凝抑制试验（HI）对临床分离株进行分型。5.1.3 腺病毒的分类分类及自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有49种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群（subgroup）。基因治疗常用的人的2型及5型腺病

48、毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常强，滴度通常可以达到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在单个细胞中的基因组拷贝数可达104（约占细胞总DNA的10%）。病毒颗粒比较稳定，通过CsCl梯度离心可以达到10101011pfu/ml，满足动物实验的要求。5.2 腺病毒诱发的疾病腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。5.2.1 呼吸道感染呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、

49、寒战、头痛和肌肉腺病毒痛等，包括以下4种不同的综合征。1急性发热性咽喉炎 通常为婴儿和儿童发病，由C组病毒引起，出现咳嗽，鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状，这些表现难以与其他病毒引起的轻型呼吸道感染鉴别。2咽结膜热（pharyngoconjunctival fever）症状与急性发热性咽喉炎相似，但常同时发生结膜炎。咽结膜热有暴发流行倾向，如游泳池结膜炎，多由B组腺病毒3和7型所致，愈后尚好，一般无后遗症。3急性呼吸道疾病（acute respiratory diseases，ARD）这一综合征由咽炎、发热、咳嗽和全身不适为特点，常在军队的新兵中流行，多因突然紧张、劳累、聚集等所致。此感染多由腺病

50、毒4、7型引起，也可见于3型。4、肺炎腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺病毒肺炎的病死率为8%10%；肺炎也是新兵急性呼吸道疾病的一种严重表现。5.2.2 眼部感染腺病毒致轻型眼部感染是呼吸道感染和咽喉炎的并发症。滤泡性结膜炎可由许多型腺病毒引起，类似于衣原体性结膜炎，而且为自限性。由腺病毒8、9和37型引起的角结膜炎为重型感染，具高传染性，以急性结膜炎开始，扩至耳前淋巴结，随后发生角膜炎。5.2.3 胃肠炎许多腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出，但大多血清型与胃肠道疾病无关。而40型和41型腺病毒可引起婴幼儿与年少（4岁以下）儿童的胃肠炎，致腹痛、腹泻。C组

51、腺病毒能引起某些婴幼儿肠套叠。5.2.4 其他疾患腺病毒11、12型能引起儿童急性出血性膀胱炎，尿中出现病毒。37型可引起女性宫颈炎和男性尿道炎，常由性传播感染。在免疫功能低下者可引起偶发或严重的病毒感染，尤其在器官移植病人中发生严重呼吸道感染和病毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多种血清型腺病毒，并能出现抗原性介于中间的杂合型毒株，而且常为致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的E1A蛋白可反式激活HIV的转录，加速HIV的复制。临床发现37%的艾滋病患者病毒性腹泻是由腺病毒所致。5.2.5 腺病毒感染后可获得对同型的持久免疫力与绝大多数呼吸道感染的病原相比，机体对腺病毒的再

52、感染能产生有效的免疫。起保护作用的是体内产生的循环中和抗体。正常的健康成人一般也具有多型的抗体。约40%60%的615岁的人具有1、2和5型中和抗体，但3、4和7型抗体很少。母亲的抗体能保护婴儿免除严重的腺病毒呼吸道感染。5.3 腺病毒的防止原则腺病毒的甲醛灭活疫苗已被用于某些人群的预防，而且将来有被用人二倍体细胞培养的减毒活疫苗所替代的可能。但因腺病毒对动物具有致癌作用，人们对全病毒疫苗的作用与安全性存有疑虑。此外加强游泳池和浴池水的消毒，可使水传播性结膜炎爆发的危险性降至最小，在作眼的检查时应严格无菌操作，对所用设备充分灭菌，也可控制流行性结膜炎的发生。对腺病毒感染的治疗仍无有效药物。第六

53、章 微生物制药的研究进展摘 要本文通过对历史文献的检索，从微生物生产维生素，微生物生产多价不饱和脂肪酸，微生物生产抗生素，微生物生产抗癌物质，微生物生产医用酶制剂等五个方面综述了微生物制药的研究进展。关键词：微生物，制药，发酵工程前 言随着生物技术的迅猛发展，在医药领域的许多方面取得了巨大的进展.，其中采用微生物制药，具有生产工艺简单，生产成本低廉，产品产量高，产品纯度高，可大规模工业化生产等优势，同样得到了巨大的发展。从传统工艺，如利用发酵工程生产抗生素、酶制剂以及B-胡萝卜素等；到现今的利用转基因技术生产干扰素、胰岛素、生长因子等几十种新药和疫苗。本文着重综述了微生物的发酵工程在医药研究和

54、生产中应用的最近进展，主要包括生产维生素、多价不饱和脂肪酸、抗生素、抗癌物质医用酶制剂等五个方面。6.1 研究内容6.1.1 微生物生产维生素维生素是六大生命要素之一, 为整个生命活动所必需。-胡萝卜素、VC、VE是目前应用最为广泛，效果最为显著的三种维生素，它们的作用分别是：-胡萝卜素是强力抗氧化剂, 有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。V C 和V E 均是抗氧化剂, 前者可阻止、破坏自由基形成，还具有激活免疫系统细胞的活力，刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子。至于VE可产生抗体，增强机体免疫力。目前，上述的“三素”以实现了微生物工业化生产。目前，-胡萝卜素主要是由三孢布拉霉菌生产，

55、在1998年，陈涛等1已经针对三孢布拉霉菌的特点，优化发酵工艺，在3M3的发酵罐中发酵120h，生产的-胡萝卜素产量已达到1146.5mg/L。虽然，传统的工艺生产-胡萝卜素的产量高，生产周期比较短，但是传统的工艺复杂，成本过高，不利于大规模工业化生产。故,目前许多课题组专注于开发新的生产-胡萝卜素的菌种或改进传统工艺。据近年所发表的期刊文献，目前，采用红酵母发酵生产-胡萝卜素是一种工艺简单，成本低廉的方法，虽然在产量方面较传统方法的低很多，但是该方法仍具有很大的发展潜力。何海燕等2采用粘红酵母R3-35摇瓶发酵84h，生产的-胡萝卜素到达12.21mg/L。胡萍等3采用酵红酵母Yh3发酵生产-胡萝卜素，其生物量及色素产量最大值分别为9.89mg/L和10.38mg/L。目前，工业生产VC采用二次发酵法，此法是在70年代初研究出来的，属于我国首创，其先进性得到国际公认。该法4以D-山梨醇为底物，用生黑醋杆菌发酵生产L-山梨糖，再采用假单胞菌发酵生产2-酮-L-古洛糖酸，最后通过化学转化生成维生素C，可达到产量130.92g/L。此后，国内外纷纷展开从D-葡萄糖串联发酵生产2-酮-