多糖药物检测方法课件

1、多糖药物检测方法1 多糖药物检测方法 多糖药物检测方法2 1、硫酸软骨素的含量测定 酸性粘多糖，维持组织和免疫机能 （1）长期应用于防治冠心病、心绞痛、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血等 疾病，无明显的毒副作用。在动脉和静脉壁上沉积的脂肪等脂质可以 被有效地去除或减少，能显著降低血浆胆固醇。 （2） 用于治疗神经痛、神经性偏头痛、关节痛等。 （3）预防和治疗链霉素引起的听觉障碍，效果显著。 （4）应用于化妆品以及外伤伤口的愈合剂等。 （5）鲨鱼软骨中的软骨素有抗肿瘤的作用。 （ 6）硫酸软骨素还用于滴眼剂。 多糖药物检测方法3 家畜、鲨鱼类动物是主要的软骨来源。但家畜的软骨产量很 低， 鲨鱼多是靠天

2、然捕获。因此, 需要进一步寻求其它易得 而又稳定的软骨来源,。鲟鱼的软骨含量相当高, 而且鲟鱼养 殖技术已成熟。 以匙吻鲟的软骨为原料, 用稀碱- 酶相结合的方法提取硫酸软 骨素 匙吻鲟软骨80 恒温蒸煮6 h洗净冷冻80 烘干 粉碎料液比1 6， 3 %碱提取，提取温度40 滤液 胰蛋白酶酶降解（用量1 000 1.5，酶解温度45 ）氯 仿萃取弃氯仿层95 %乙醇沉淀（沉淀时的pH7.0 ）过 滤 60 干燥成品 硫酸软骨素提取率为36.52 %、纯度为97 %、蛋白质含量为 0.075 %、水分为10.52 %。 多糖药物检测方法4 检测方法 （1）比色法 适量样品用6M HCL 酸水解

3、2小时，中和 与乙酰丙酮反 应25分钟，生成色原物质，冷却，然后再与无醛乙醇60反 应1小时，525nm 处测定吸光度,盐酸氨基葡萄糖做对照 (2)紫外法 样品与硫酸95共热水解1小时,288nm 处测吸光值。 需做标准曲线 多糖药物检测方法5 （3）毛细细管电泳测定硫酸软骨素 毛细管电泳条件：毛细管内径50m ；有效长度50cm 缓冲盐：50m M磷酸二氢钾溶液，pH=3.5 进样量：5sec, 0.5 毫升 分离电压：28kV 样品处理：称取各种待测样品约1.0g，用10mL乙腈分散， 定容至100mL。 氨基葡萄糖标准曲线（5.070mg/mL-0.507mg/mL）： y=8338.7

4、x+1607.7， R2=0.9999 硫酸软骨素标准曲线（4.731 mg/mL-0.473mg/mL）： y=344781x+58652， R2=0.9958 多糖药物检测方法6 香菇多糖的测定香菇多糖的测定 香菇多糖是主链是（13）糖苷链连接的葡 聚糖。 用这种多糖以2mg/kg剂量腹腔注射已移植肿瘤 的大鼠连续5天，结果表明它对肉瘤的抑制率达 83%，而相同剂量的经切支水解后得到的较小分 子香菇多糖对肉瘤的抑制量更高，达97%以上。 多糖药物检测方法7 机理： 有人合成了含有同位素的香菇多糖，并在移植了肿有人合成了含有同位素的香菇多糖，并在移植了肿 瘤的小鼠身上做示踪试验，结果发现它瘤

5、的小鼠身上做示踪试验，结果发现它不具备直接杀伤不具备直接杀伤 肿瘤细胞的能力肿瘤细胞的能力。随后的大量试验表明它是作为调节机。随后的大量试验表明它是作为调节机 体免疫反应的体免疫反应的T细胞促进剂细胞促进剂，通过刺激抗体的产生提高机，通过刺激抗体的产生提高机 体的免疫能力，从而达到抵抗肿瘤的作用体的免疫能力，从而达到抵抗肿瘤的作用。 香菇多糖注射液香菇多糖注射液(治慢性肝炎及肿瘤治疗的辅助治慢性肝炎及肿瘤治疗的辅助 药药); 香菇多糖的测定香菇多糖的测定 多糖水解成单糖进行测定（滴定法）多糖水解成单糖进行测定（滴定法） 含量含量=样品水解后单糖总含量样品水解后单糖总含量- 未水解样品中单糖的未

6、水解样品中单糖的 含量含量 多糖药物检测方法8 香菇多糖的提取方法香菇多糖的提取方法 1.预处理：取干香菇，捣碎。预处理：取干香菇，捣碎。 2.提取：将捣碎的干香菇，在搅拌的条件下加提取：将捣碎的干香菇，在搅拌的条件下加67倍量水混倍量水混 匀，加热至匀，加热至90，搅拌保温，搅拌保温60 min。 降温至降温至40时转移到时转移到40水浴保温，水浴保温，p H64，搅拌，搅拌 反应反应60 min，然后迅速升温到，然后迅速升温到90-100，灭活，灭活1min降温降温 后纱布过滤，收集滤液。后纱布过滤，收集滤液。 3.浓缩：将以上滤液浓缩至浓缩：将以上滤液浓缩至l/5体积。体积。 4.沉淀：

7、将浓缩液加沉淀：将浓缩液加1倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得沉沉 淀物淀物，滤液再加，滤液再加3倍量乙醇，得沉淀物。倍量乙醇，得沉淀物。 多糖药物检测方法9 5.二次沉淀：将沉淀物置于搪瓷缸中，加约二次沉淀：将沉淀物置于搪瓷缸中，加约70倍量的倍量的 水，搅拌均匀，在猛烈搅拌下，滴加水，搅拌均匀，在猛烈搅拌下，滴加0.2mol/L氢氧氢氧 化十六烷基三甲基胺水溶液，逐步调化十六烷基三甲基胺水溶液，逐步调PH至至12.8时产时产 生大量沉淀，离心，生大量沉淀，离心，沉淀沉淀用乙醇洗涤，收集沉淀。用乙醇洗涤，收集沉淀。 6.除蛋白：沉淀用氯仿、正丁醇洗涤去蛋白，水层加除

8、蛋白：沉淀用氯仿、正丁醇洗涤去蛋白，水层加3 倍量乙醇沉淀，收集沉淀。倍量乙醇沉淀，收集沉淀。 7.洗涤：沉淀依次用甲醇、乙醚洗涤，收集沉淀。洗涤：沉淀依次用甲醇、乙醚洗涤，收集沉淀。 8.干燥：将沉淀置真空干燥器干燥，即为香菇多糖干燥：将沉淀置真空干燥器干燥，即为香菇多糖。 多糖药物检测方法10 灵孢多糖灵孢多糖 灵芝，又称万年蕈、灵芝草，为灵芝属真菌, 有着悠 久的药用历史。目前，有关灵芝活性元素的研究主要集在： 灵芝多糖类、灵芝三萜类等成分上。 灵芝多糖可抑制肿瘤细胞的无限、快速分裂能力，还 具有提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，降血糖降血 脂作用。 灵芝多糖产品：灵芝多糖产品： 灵芝

9、多糖片、灵芝复方糖浆等灵芝多糖片、灵芝复方糖浆等(主要用于肿瘤辅助主要用于肿瘤辅助 治疗，慢性气管炎、高血压、神经衰弱、糖尿病、治疗，慢性气管炎、高血压、神经衰弱、糖尿病、 高血脂等高血脂等); 多糖药物检测方法11 检测方法检测方法 (1)对照品溶液的制备 取葡萄糖，加水制成1.0mg/ml的溶液。 (2)供试品溶液的制备 取本品3.0ml，加水定容至200ml。 (3)标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1.0ml，2.0ml， 4.0ml，6.0ml，和8.0ml，加水定容至100ml。各精密量 取1.0ml，分别置具塞试管中，置冰浴中，分别加入蒽酮 试剂5.0ml，摇匀，各试管加完后浸入

10、沸水浴中，加热 1min后，加塞。自水浴重新沸腾起，开始计时，10min后 取出，用自来水冷却，室温放置10min，立即在620nm分 别测定吸光度，以测得的吸光度对相应的浓度计算回归方 程，相关系数不得低于0.99。 (4)含量测定（含多糖以葡萄糖计） 精密量取供试品1.0ml， 照标准曲线制备项下自“分别置具试管中”起，依法同步 操作，测定吸光度，由回归方程计算多糖含量。 多糖药物检测方法12 肝素的检测 1.结构与性质 肝素分子是有六糖或八糖重复单位组成的线形 分子，含2-硫酸艾杜糖醛酸6-硫酸-N-硫酸氨基葡 萄糖及葡萄糖醛酸等残基。由不同链长的许多组 分组成。 肝素的N-硫酸基对酸水

11、解敏感，与氧化剂反应， 能被降解成酸性产物。肝素呈弱酸性，某聚阴离 子与各种阳离子反应生成盐，与碱性染料反应， 对染料的光吸收有影响。 多糖药物检测方法13 2.效价的测定 （1）天青A法 含氨基碱性染料（天青A、甲苯胺蓝、天青）有一定 最大吸收，结合了肝素后，则最大吸收向短波移动。使用 天青A比色测定肝素效价。 标准曲线绘制：精密量取肝素标准液（1.2U/ml）1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 各以蒸馏水补足到5ml，在各加巴以妥缓 冲液（PH=6.8）1ml及0.1%西黄耆胶溶液1ml，0.018%天 青A溶液1ml，摇匀后，于505nm处测吸光度。以效价单 位为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 供试品测定：精密称取供试品适量，按估计效价，以蒸 馏水配每ml含肝素0.5-1.0单位。取供试品溶液5ml，按标 准曲线方法测吸光度，差曲线计算效价。 多糖药物检测方法14 （2）色原底物法 此法原理是基于肝素与抗凝酶（AT-）的复合物对Xa 因子（FXa）或凝血酶有抑制作用。残余的FXa或凝血 酶用某些色原底物测出，量与肝素呈负相关。鉴于肝素 的抗FXa活性对抗血栓效应的重要性，美国药典把色原 底物测定