高表达稳定株的构建

1、 实验的步骤实验的步骤： GDF15基因的提取及PCR扩增 载体质粒的提取(细菌的培养和质粒的提取) 双酶切 连接 转化到细菌（感受态的制备） 双酶切鉴定，基因测序鉴定 扩大培养细菌和重组质粒提取 病毒制备 1. 转染细胞筛选稳定表达GDF15蛋白的细胞 Gdf15基因所在细胞的RNA的提取 反转录cDNA Gdf15基因引物设计（注意要加上酶切位点序列） PCR扩增Gdf15基因 凝胶电泳及PCR产物回收 利用Vector NTI 8.0软件设计NPM1基因序列扩增引物， 在引物两端分别加EcoR I、BamH I酶切位点和3个保护 碱基 引物名称 序列 , FWDGCGGAATTCATGG

2、AAGACTCGATGGATATGGACATG , REVGCGGGATCCTTAAAGAGATTTCCTCCACTGCCAGAG 下划线标示出限制性酶切位点 / Addgene: pLJM1-EGFP 举例： 1细菌： Stbl3菌株、DH5菌株 2质粒 pCDNA3.1质粒、pLJM1质 粒、V51-S3质粒 甘油菌种（甘油菌种（-80-80度保存）度保存）1ml 1ml 方法一：方法一： 直接取直接取10ul10ul至至4ml4ml培养基培养基中，中， 加上相应加上相应抗生素抗生素，进行培养，进行培养 （3737度度250 rpm250 rpm培

3、养培养12 h12 h左右）左右） 然后做个菌落然后做个菌落PCRPCR，如果有目，如果有目 的条带，拿去测序。当然如果的条带，拿去测序。当然如果 以前做过测序的话，就不需要以前做过测序的话，就不需要 再测啦。再测啦。 超净工作台、酒精灯、移液枪、超净工作台、酒精灯、移液枪、 灭菌锅、试管、三角烧瓶、恒灭菌锅、试管、三角烧瓶、恒 温摇床温摇床 试剂试剂 LB培养基：培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4-7.6） 抗生素：抗生素：氨苄、卡那霉素 灭菌接种环灭菌接种环 沾取标本沾取标本 接种划线接种划线 37度培养

4、过夜度培养过夜 方法二：平板划线接种法方法二：平板划线接种法 挑取单克隆挑取单克隆 扩大培养扩大培养 灭菌锅、三角烧瓶、平板皿、超净工作台、灭菌锅、三角烧瓶、平板皿、超净工作台、 接种环、酒精灯、恒温培养箱、移液枪、接种环、酒精灯、恒温培养箱、移液枪、 试管、恒温摇床试管、恒温摇床 试剂试剂 LB固体培养基：固体培养基： Tryptone 10 g/L ， Yeast extract 5 g/L， NaCl 5 g/L（ph7.4- 7.6）琼脂琼脂1.5% 抗生素：抗生素：氨苄、卡那霉素 注意：注意： 。 方法一：SDS碱裂解法少量抽提质粒DNA 裂解：裂解： 取1.5 mL菌液离心(120

5、00 rpm，1 min), 尽可能地吸干培养液。将沉淀重悬于 150ul的碱裂解液碱裂解液I I中，剧烈振荡。 加入200 ul现配的碱裂解液现配的碱裂解液II II，轻轻地快速颠倒混匀5次，冰浴5min。 从冰箱中取出碱裂解液碱裂解液IIIIII，加入150ul至EP管中颠倒混匀，冰浴5 min后离心。 加入等体积的酚和氯仿酚和氯仿后离心，小心地吸取上清液到新的管中。 回收质粒回收质粒DNADNA: 加入双倍体积的无水酒精无水酒精，充分混匀后，冰浴3h。4度离心10 min,弃上清。 加入1 mL的70%70%的无水酒精的无水酒精清洗一次，4 C, 12000 rpm离心10 min，弃上

6、清， 将开口的EP管于室温下使酒精挥发，约10 min左右。用50 ul的RNARNA酶酶（40 uL/mL)的ddH2O重新溶解核酸，温和的振荡几秒，-20度保存备用。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 离心机离心机、移液枪、冰盒、移液枪、冰盒、EPEP管等管等 试剂试剂 碱裂解液碱裂解液： 50nmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 碱裂解液碱裂解液： 0.2N NaOH（从10N贮存液中现用现稀释）；1%（m/V）SDS 碱裂解液要现用现配制，室温下使用。 碱裂解液碱裂解液： 5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸

7、11.5ml；H2O 28.5ml，保存在4 C。 方法二、质粒小抽试剂盒（天根、方法二、质粒小抽试剂盒（天根、Axgen） 简单快速方便、价格也便宜简单快速方便、价格也便宜 EcoR I EcoR I 和和BamH I BamH I 双酶切双酶切 用限制性内切酶EcoR I 和 BamH I 双酶切载体V51-S3 和NPM1基因片段，37 C，4 h。 酶切产物回收（胶回收试剂盒） 将NPM1基因双酶切片段与线 性化载体V51-S3连接重组， 16水浴连接过夜。 1）取10 L连接产物加入到100 l E.coli DH5E.coli DH5感受态感受态中， 轻轻吹打混匀，冰上放置30 m

8、in； 2） 4242热激热激90 s90 s，冰浴，冰浴5 min5 min； 3） 加入1 mL 37预热的LB液体培养基，37，250 rpm 摇菌复苏复苏1 h； 4） 3000 rpm离心2 min，吸去上清，剩余100 L 菌液用移 液枪吹打重悬菌体，涂布于LB/氨苄青霉素（100g/ml） 平板上（涂平板），（涂平板），37正置培养正置培养30 min，然后倒置培养 12 h左右； 5） 挑转化后的若干个单克隆菌落若干个单克隆菌落接种到4 mL LB/氨苄青 霉素（100 g/ml）液体培养基中，37，250 rpm培养12 h 左右，用于提取质粒。 1） 挑E.coli DH5

9、单克隆菌落接种到4mL LB液体培养基中， 37，250 rpm摇菌12-14 h； 2） 接种2 mL培养的菌液到含有100 mL LB液体培养基培 养瓶中，37，250 rpm摇菌至摇菌至OD600OD600为为0.3-0.50.3-0.5； 3） 将菌液倒入50 mL灭菌离心管中，冰浴冰浴20 min后，4， 3000 rpm离心10 min； 4） 吸去上清，用20 mL20 mL冰冷的冰冷的50 mM CaCl50 mM CaCl2 2溶液轻轻重悬溶液轻轻重悬 菌体菌体，冰浴30 min； 5） 4，3000 rpm离心10 min，吸去上清，用4 mL4 mL冰冷的冰冷的 CaCl

10、CaCl2 2溶液（溶液（3.25 ml 50 mM CaCl3.25 ml 50 mM CaCl2 2溶液和溶液和0.75 mL 80%0.75 mL 80%甘油混甘油混 合）轻轻重悬菌体合）轻轻重悬菌体，即为感受态细胞； 6） 每管100 L分装于1.5 mL离心管中，-80保存备用。 基因测序鉴定 碱裂解法大量抽提质粒（200+ml 菌液） 1) 细胞转染前将293T293T细胞细胞以1.5106的密度培养于10 cm细胞培 养皿中培养24 h，保证转染时细胞汇合度达到50%-60%。 2) 转染前3 h将待转染细胞培养基换为无血清无血清MEMMEM培养基培养基。 3) 取16 g质粒（

11、7.5g pLKO.1；2.9 g PCMV-VSVGPCMV-VSVG；5.6 g 5.6 g PCMV-dR8.2PCMV-dR8.2）至0.5 ml无血清MEM培养基中，轻轻吹打混合 均匀。再取15L LipofectamineLipofectamine 2000 2000至0.5 mL无血清MEM培 养基中，轻轻吹打混合均匀，室温孵育5 min。混合两份培养 基（总体积1.0mL）轻轻吹打混合均匀，室温孵育25 min。 4) 在待转染细胞中加入4 ml无血清培养基，逐滴加入步骤3的 混合液。轻轻晃动培养皿使溶液混均，放至37，CO2培养箱 中培养6 h后换成10%血清的DMEM培养基培养。 5) 48 h后收集病毒，取上清培养基至15 mL离心管中，2000 rpm， 4离心7 min收集上清，4保存，如需长期