基于稀疏轮廓扫描的滑动焦点光声显微成像方法

1、基于稀疏轮廓扫描的滑动焦点光声显微成像方法摘要：在基于光声共焦的超声分辨光声显微成像系统中，只有焦点处的吸收体可以获得高分辨率高信噪比的成像，而实际的生物组织往往具有不规则的轮廓，导致成像结果分辨率和信噪比不均匀。本文提出了一种基于手动描绘轮廓的滑动焦点光声显微成像方法，首先在固定的焦点上稀疏扫描轮廓，结合人工选择轮廓点获取轮廓的稀疏矩阵，然后通过线性拟合获取完整的轮廓矩阵，并将轮廓矩阵的信息转化为焦点位置信息，最后进行二次扫描，根据焦点的位置信息在每次扫描之前调整焦点位置，使得在整个扫描过程中，样品始终处于焦点的位置，从而获得分辨率和信噪比均匀的光声显微图像。通过在体皮下血管成像和皮下肿瘤血

2、管再生成像，证明了该方法可以有效提高光声成像的质量。关键词：图像处理；光声成像；滑动焦点1 引言光声显微成像（photoacoustic microscopy）是光声成像技术的一种新兴模式，通过使用聚焦型超声传感器探测1，或者聚焦光入射2的办法，目前已实现亚波长的高分辨成像3，在生物医学研究和临床应用等领域展示了巨大的潜力。通过暗场反射式照明配合聚焦型超声探头，实现了轴向15 um、侧向45 um的分辨率以及3 mm的最大成像深度，目前已用于小动物的皮下血管成像4、肿瘤及周围血管结构与功能成像5、颅下血管成像6等领域。相对于激光散斑成像、光学相干成像、共聚焦显微成像等高分辨光学成像技术，光声显

3、微成像可以在更深的深度实现高分辨的内源及外源信号成像。暗场反射式光声显微成像的系统描述和成像原理可在文献7中找到，这里简要介绍一下系统的图像重建，通过时间分辨的超声探测，乘以超声在组织中的传输速度，可以获取x-y平面上一个位置的深度信息（a scan），通过沿x轴扫描，可以获取x-y平面上一条线的截面信息（b scan），通过在x-y平面上二维光栅扫描，可以获取三维的结构信息（c scan），通过三维可视化重建，即可得到组织的三维结构图。除此之外，二维的最大值投影图（map）使用也很广泛，由于血液的吸收远大于周围组织，所以血管的光声信号远大于周围组织，从而在某个方向上求取最大值，可以保留血管的

4、信号，当然最常用的还是在深度方向上求取最大值投影，这样不但可以获取x-y平面上的血管分布，而且可以抵消部分运动伪迹。本文展示的结果主要采用b型扫描和沿深度方向最大值投影图的形式。在暗场反射式光声显微成像系统中，为了实现高分辨的光声显微成像，需要使用高中心频率、宽带宽、高数值孔径的球形聚焦超声传感器，而这种结构设计的劣势就是焦深也随之降低8，这导致当成像物体离焦时，成像质量会迅速下降，在传统的扫描方式下，探头在x-y平面上以固定的高度扫描，样品的轮廓波动大于焦深时就会导致部分区域的成像质量下降，在重建图像上直观的表现为分辨率下降导致的血管变粗以及信噪比的下降。一维8和二维9数值孔径合成算法可以在

5、一定的离焦范围内改善这种恶化，但是目前只有一定的方向上进行合成才能获得比较好的效果，而且这种算法并未考虑组织与水的不同声阻抗参数，故而存在一定的误差10。因此有必要设计出一种能够使得探头的焦点沿样品轮廓扫描的方法和系统，保证成像的分辨率和信噪比在整幅图像上一致。本文设计了一种基于轮廓扫描的滑动焦点光声显微成像方法，并在现有的光声显微成像系统上实现了该方法，通过在成像前稀疏扫描样品轮廓，人工选择部分轮廓点结合线性插值的办法获取样品的轮廓矩阵，并将轮廓矩阵信息转化为焦点的位置移动信息，在成像时每移动一个位置，就相应调整焦点的位置，使得在整个扫描过程中样品始终处于焦深范围内，从而获得均一、高分辨、高

6、信噪比的图像。2 方法2.1 轮廓信息的获取焦点的滑动是按照轮廓信息来执行的，因此在成像之前需要首先获取轮廓信息，这一过程主要分为以下两步：2.1.1 稀疏轮廓b型图像的获取稀疏轮廓b型扫描基于传统的固定焦点扫描，样品放置好之后，先将焦点调整到感兴趣区域，然后扫描多个位置的b型图像，位置的选取要充分考虑样品表面轮廓的波动情况，当波动较大时，可以适当的密集扫描b型图像，当波动较小时，可以适当的稀疏扫描b型图像。为了方便后面的插值，一般要求轮廓b型图像的扫描要包括视场的边界。2.1.2 轮廓矩阵的获取获取轮廓稀疏b型扫描图像之后，需要人工介入选择每幅b型图像上的轮廓位置，然后通过biharmoni

7、c样条曲面插值获取整个视场中的轮廓点位置（aij），该插值方法的原理简述如下11：对于二维空间中分布的n个控制点，i=1n，biharmonic样条曲面插值可以转化为求取方程组（1）的解：（1）其中为biharmonic算子，为单位冲击函数，p为二维空间中待插值的位置，为p处插值的结果。方程组（1）的解为：（2）式中的可以通过求解线性方程组（3）获得：（3）式中为二维green函数，即。插值得到的轮廓矩阵aij即为（2）式中的。该插值方法整体平滑且局部性能好，而且对控制点的分布和数量没有限制12。插值得到的位置是绝对位置，为了避免水和组织声阻抗特性的差异造成的误差，将绝对位置换算为相对位置：（

8、4）式中rij为每次b型扫描的焦点移动矩阵，ti为每次b型扫描起点的焦点移动矩阵，即认为在起始点时感兴趣区域（如血管）处于焦深范围，后面各点的扫描焦点的移动均以该点为参照。将相对位置矩阵乘以z轴每个像素代表的深度（6 um），即可得到焦点的移动信息矩阵，由于z轴的移动指令数据格式为整形，所以最后还需要进行数据格式转换。轮廓信息的获取过程示意如图1所示。图 1 轮廓信息的获取过程示意2.2 滑动焦点扫描滑动焦点扫描依然基于b型扫描，每次b型扫描之前，首先将该线所对应的焦点移动矩阵（aik）送入内存，然后在激光器触发脉冲的触发下依次完成信号的采集、扫描轴（x轴）的步进以及焦点（z轴）的调整。一次b

9、型扫描完成之后，扫描轴电机回归至初始位置，正交轴（y轴）步进，同时z轴带动焦点也回归到起始点的位置，这时再将tk送入内存，控制焦点移动到下一条b型扫描线的起始位置，重复上述b型扫描过程，完成整个视场的扫描。这里之所以在每条b型扫描线结束后焦点归零（起始位置），是为了防止扫描过程中的一个可能的焦点移动错误带入到后面的扫描过程中，从而避免了误差的蔓延与累积。滑动焦点扫描过程对应于图2所示的流程图。图2 滑动焦点扫描流程图3 实验3.1 模型实验对一块表面包被黑色pvc绝缘胶带的圆柱形金属块沿横截面方向进行b型扫描，扫描图像如图3a所示，图中自上而下第一条亮带为绝缘胶带的上表面产生的光声信号，第二条

10、亮带为绝缘胶带的下表面产生的光声信号，在9 mm的扫描范围内，绝缘胶带竖直方向的跨度约为1 mm，超出了超声探头的焦深（约0.3 mm），因此图像两侧的信噪比逐渐下降。采用滑动焦点扫描的图像如图3b所示，由于探头沿着胶带的轮廓滑动，因此b型扫描的结果不再有明显的弧度，而且均处于焦深范围内，表现出一致的信噪比。这里需要说明的是：图3b中的亮带可见细微波动，主要原因在于插值的误差和电机驱动的格式转换误差，但图中的亮带波动峰值在70 um以内，因此依然处于焦深范围内。图3 表面包被黑色pvc胶带的圆柱块b型扫描结果。a为固定焦点扫描结果，b为滑动焦点扫描结果3.2 小鼠皮下血管成像使用一只26 g的

11、昆明小鼠进行在体实验证明该方法对皮下血管成像的有效性，实验使用584 nm的激光激发光声信号，在这个波长下血液产生的光声信号比周围软组织高出10倍以上5。实验前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg乌拉坦进行麻醉，对该小鼠的背部同一区域的皮下血管先后进行固定焦点扫描成像和滑动焦点扫描成像，实验结果如图4所示，其中a为固定焦点扫描的最大值投影图，b为滑动焦点扫描的最大值投影图，可以明显的看出，a图左侧由于离焦导致血管逐渐模糊，而且信噪比逐渐下降，而滑动焦点的方法可以使得图像具有均匀的分辨率和信噪比，在最大值投影图上表现为整个视场内血管清晰可辨。c和d分别为a和b图中虚线标示位置的b型扫描

12、结果图，可以清晰的看到由于沿着轮廓扫描，滑动焦点的结果保证了皮下血管均处在焦深的范围内。图4 皮下血管扫描结果对比。(a)固定焦点扫描最大值投影图；(b)滑动焦点扫描最大值投影图；(c)和(d)分别为(a)和(b)中虚线所示区域的b型扫描结果3.3 大鼠颅下血管成像使用一只140 g的wistar大鼠进行在体实验证明该方法对颅下血管成像的有效性，实验依然使用584 nm的激光激发光声信号。实验前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg乌拉坦进行麻醉，然后将图5a黑色方框所示区域的颅骨敲除，对该区域的颅下血管先后进行固定焦点扫描成像和滑动焦点扫描成像，实验结果分别如图5b和5c所示，图5b

13、自上而下血管逐渐模糊，同时伴随着信噪比逐渐下降，而滑动焦点的方法沿着颅骨的走向移动焦点，从而在整个视场内血管清晰可辨。图5 颅下血管扫描结果对比。(a)开颅成像区域示意图；(b)固定焦点扫描结果；(c)滑动焦点扫描结果3.4 荷瘤小鼠皮下血管再生成像对一只背部种有b16黑色素瘤细胞的c57小鼠（体重26 g）进行成像，肿瘤直径约有1 cm，凸起约有3 mm，同时导致肿瘤周围皮肤有1 mm左右的起伏。成像前腹腔注射0.2 g/kg水合氯醛和1 g/kg乌拉坦进行麻醉，用脱毛膏对肿瘤及周围区域脱毛，利用滑动焦点扫描的方法对黑色素瘤周围的皮下血管进行成像，成像结果如图6所示。虽然肉眼还无法识别成像区

14、域是否已侵染肿瘤，但是从光声成像的结果可以看出，血管的形状变得异常，分布也变得杂乱无章，同时信噪比下降，表明肿瘤已经在逐渐侵染这一区域。图6的右上角为黑色素瘤部位，由于肿瘤部位分泌了非常多的黑色素，导致光声信号非常强。待添加的隐藏文字内容2图6 肿瘤周围皮下血管光声显微成像结果4 结论本文设计了一种滑动焦点光声显微成像方法及系统，并通过模型实验、在体皮下血管成像和颅下血管成像证明了该方法的有效性，最后展示了这种方法对于肿瘤周围血管成像的结果。本文提出的方法在获得轮廓信息时需要人工介入，事实上在实际应用中完全可以根据样本的信号特点进行计算机拟合，本文提出的方法预留了这种改进的接口函数，可以很方便

15、的实现自动获取轮廓，但是需要指出的是，由于生物组织的多样性，很难保证一种计算机拟合方法在所有的样品上获得好的效果，因此，人工介入的办法依然具有很强的实用性。参考文献1 k. maslov, g. stoica,l. h. v. wang, in vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopyj, optics letters, 2005, 30(6): 625-627.2 k. maslov, h. f. zhang, s. hu, etc, optical-resolution photoacoustic microscopy

16、 for in vivo imaging of single capillariesj, optics letters, 2008, 33(9): 929-931.3 c. zhang, k. maslov,l. h. v. wang, subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivoj, optics letters, 2010, 35(19): 3195-3197.4 h. f. zhang, k. maslov,l. h. v. wang, in vivo

17、imaging of subcutaneous structures using functional photoacoustic microscopyj, nature protocols, 2007, 2(4): 797-804.5 h. f. zhang, k. maslov, g. stoica, etc, functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imagingj, nature biotechnology, 2006, 24(7): 848-851.6 l. d.

18、liao, m. l. li, h. y. lai, etc, imaging brain hemodynamic changes during rat forepaw electrical stimulation using functional photoacoustic microscopyj, neuroimage, 2010, 52(2): 562-570.7 x. q. yang, x. cai, k. maslov, etc, high-resolution photoacoustic microscope for rat brain imaging in vivoj, chinese optics letters, 2010, 8(6): 609-611.8 m. l. li, h. f. zhang, k. maslov, etc, improved in vivo photoacoustic microscopy based on a virtual-dete