武汉大学临医免疫学试验课

1、一、间接免疫荧光（写实验报告）一、间接免疫荧光（写实验报告） 二、二、 ELISA法检测法检测HBs-Ab（写实验报告）（写实验报告） 三、凋亡细胞的三、凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳分析 （写实验报告）（写实验报告） 第二次第二次 实验课内容实验课内容 免疫标记技术免疫标记技术 免疫标记技术是指用酶、荧光素、同位素等标免疫标记技术是指用酶、荧光素、同位素等标 记分子标记记分子标记Ab或或Ag，通过酶联比色仪、荧光通过酶联比色仪、荧光 显微镜或放射测定来定量检测显微镜或放射测定来定量检测AgAb反应。免反应。免 疫标记技术不改变标记的疫标记技术不改变标记的Ag或或Ab的性质，

2、不的性质，不 改变包被的改变包被的Ag或或Ab的性质，不影响的性质，不影响AgAb反应反应 的特异性的特异性 。该技术具有灵敏性高及特异性强，。该技术具有灵敏性高及特异性强， 既能定性、定量，又能定位检测的特点。既能定性、定量，又能定位检测的特点。 免疫标记技术包括免疫酶技术（免疫标记技术包括免疫酶技术（ 如酶联免疫吸如酶联免疫吸 附试验）、附试验）、 免疫荧光技术、放射免疫测定等方免疫荧光技术、放射免疫测定等方 法。法。 免疫荧光技术免疫荧光技术 是利用荧光素标记的抗体来分析或定位相应是利用荧光素标记的抗体来分析或定位相应 抗原，以测定细胞相应抗原的存在。广泛应用于抗原，以测定细胞相应抗原的

3、存在。广泛应用于 免疫学中的一种荧光素是异硫氰酸荧光素（免疫学中的一种荧光素是异硫氰酸荧光素（ FITC），），当在荧光显微镜下用紫外线照射时，当在荧光显微镜下用紫外线照射时， 发出可见的黄绿色荧光。另一个广泛应用的荧光发出可见的黄绿色荧光。另一个广泛应用的荧光 素是藻红蛋白（素是藻红蛋白（PE），），发出可见的红色荧光。发出可见的红色荧光。 免疫荧光技术分为直接法、间接法和补体法等。免疫荧光技术分为直接法、间接法和补体法等。 免疫荧光技术免疫荧光技术- -直接法直接法 免疫荧光技术免疫荧光技术- -间接法间接法 免疫荧光技术免疫荧光技术- -补体法补体法 补体法补体法 实验三实验三 间接免疫

4、荧光间接免疫荧光 原理原理 间接免疫荧光法是用荧光素标记二抗以检间接免疫荧光法是用荧光素标记二抗以检 测测Ag或或Ab的一种实验技术。其原理是的一种实验技术。其原理是Ag首首 先与一抗结合，然后一抗再与荧光素标记先与一抗结合，然后一抗再与荧光素标记 的二抗结合，形成一个的二抗结合，形成一个Ag- Ab1-荧光素标记荧光素标记 Ab2的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现 荧光。荧光。 实验材料：实验材料： 抗原：分离人抗原：分离人PBMC 一抗：兔抗人白细胞血清一抗：兔抗人白细胞血清 二抗：二抗：FITC-抗兔单克隆抗体抗兔单克隆抗体 已划好标记圈的标本片已划好标

5、记圈的标本片 洗脱液（洗脱液（PBS） 间接免疫荧光法操作步骤：间接免疫荧光法操作步骤： 一、分离新鲜人血清中的一、分离新鲜人血清中的PBMC 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 - 葡蔗糖葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法 原理原理 外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单核细包括淋巴细胞、单核细 胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和 多核细胞比重较大，为多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核左右，而淋巴细胞和单核 细胞比重为细胞比重为1.075左右。利用比重为左右。利用比重为

6、1.077左右的分层液左右的分层液 作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布作密度梯度离心，使一定比重的细胞按密度梯度分布 ，从而将各种血细胞加以分离。，从而将各种血细胞加以分离。 材料材料 1、淋巴细胞分层液（葡蔗糖、淋巴细胞分层液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重为泛影葡胺，比重为 1.0770.001g/L） 2、 Hanks液或者液或者RPMI-1640培养基培养基 3、试管、吸管、水平离心机等、试管、吸管、水平离心机等 方法方法 1、无菌采集静脉血、无菌采集静脉血2-3ml，注入盛有肝素的抗，注入盛有肝素的抗 凝试管中，混匀。凝试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液、吸取淋巴细胞分层液3

7、ml加入离心管中，再加入离心管中，再 将稀释抗凝血液将稀释抗凝血液2ml（剩余的抗凝血离心取血剩余的抗凝血离心取血 浆作检测浆作检测HBsAb用用)小心沿管壁小心沿管壁加至分层液上加至分层液上 ，应注意，应注意保持两者界面清晰。（关键）保持两者界面清晰。（关键） 3、室温、室温2000rmin离心离心20min。管内可分为四管内可分为四 层。层。 4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞， 加入到加入到1.5ml 的的EP管中作细胞抗原备用。管中作细胞抗原备用。 （淡黄色淡黄色） （乳白色乳白色） （无色无色） （白色白色） （红色红色） 二、二、 涂细

8、胞抗原片涂细胞抗原片 将将PBMC用适量用适量PBS稀释，取稀释，取10l左右液体滴加到标本片黑色左右液体滴加到标本片黑色 圈圈背面中央。静止圈圈背面中央。静止5-10分钟，待分钟，待PBMC干燥。固定。干燥。固定。 三、加入一抗三、加入一抗 将稀释好的一抗约将稀释好的一抗约15 l滴加到涂有细胞的标本片处（可看到滴加到涂有细胞的标本片处（可看到 一小薄层圆圈），一小薄层圆圈），37，湿盒孵育，湿盒孵育30分钟。分钟。 四、漂洗阶段。四、漂洗阶段。 甩干标本片上液体，小心擦去圆圈周围的残余液体，于圆圈甩干标本片上液体，小心擦去圆圈周围的残余液体，于圆圈 中央滴加洗脱液中央滴加洗脱液1滴，水平来

9、回震荡，静置滴，水平来回震荡，静置5分钟，再甩去液分钟，再甩去液 体。重复上述步骤，洗涤体。重复上述步骤，洗涤5次。次。 五、加入荧光二抗（五、加入荧光二抗（整个实验过程需关闭强烈光源，避光！整个实验过程需关闭强烈光源，避光！） 将二抗约将二抗约15 l滴加到涂有细胞的标本片上（可看到一小薄层滴加到涂有细胞的标本片上（可看到一小薄层 圆圈）。圆圈）。37，湿盒避光孵育，湿盒避光孵育30分钟。分钟。 六、漂洗阶段。同步骤六、漂洗阶段。同步骤4，洗涤，洗涤5次。次。 七、镜检。七、镜检。 将干燥后标本片移至荧光显微镜下观察将干燥后标本片移至荧光显微镜下观察 结果。结果。FITC为绿色荧光。为绿色荧

10、光。 结果观察：荧光显微镜观察：暗背景中有绿色荧光细胞荧光显微镜观察：暗背景中有绿色荧光细胞 实验四实验四 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) Ab 或或Ag与酶连接后，仍保持免疫活性和与酶连接后，仍保持免疫活性和 酶活性，当相应酶活性，当相应Ag、Ab特异性结合后，其分子上的特异性结合后，其分子上的 酶作用相应底物时，可引起底物水解显色，根据颜酶作用相应底物时，可引起底物水解显色，根据颜 色的有无和深浅来检测色的有无和深浅来检测Ab或或Ag。 常用常用ELISA检测方法有：间接法、抗原竞争法、夹检测方法有：间

11、接法、抗原竞争法、夹 心法（双抗体夹心法、双抗原夹心法）和其他方法。心法（双抗体夹心法、双抗原夹心法）和其他方法。 间接法 基本原理与类型基本原理与类型 双抗体夹心法双抗体夹心法 竟争法 实验条件选择：实验条件选择： 固体载相固体载相：纤维素、聚苯乙烯板：纤维素、聚苯乙烯板 底物底物：价廉、安全、本身无色、酶解后出现颜色：价廉、安全、本身无色、酶解后出现颜色 终止反应终止反应：强酸、强碱，以保持实验时间不需太长：强酸、强碱，以保持实验时间不需太长 终点测定终点测定：目测、分光光度计：目测、分光光度计 酶酶：辣根过氧化物酶（：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）

12、 底物底物： 分解后颜色分解后颜色 溶解度溶解度 邻苯二胺（邻苯二胺（OPD） 深桔黄色深桔黄色 大大 3,3,5,5,-四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMB ） 蓝绿色蓝绿色 大大 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP) 底物底物： 分解后颜色分解后颜色 溶解度溶解度 萘酚（萘酚（AS-mx）、）、快蓝（快蓝（FB） 蓝色蓝色 小小 快红（快红（FR） 红色红色 小小 ELISA（双抗原夹心法）查双抗原夹心法）查HBs-Ab 原理原理 采用纯化采用纯化HBsAg包被酶标板，加入待测标包被酶标板，加入待测标 本，同时加入酶标抗原（本，同时加入酶标抗原（HBsAg-

13、HRP） ，当标本中存在抗当标本中存在抗HBsAg的抗体的抗体HBsAb 时，时，HBsAb与包被与包被HBsAg结合并与结合并与 HBsAg-HRP结合形成结合形成HBsAgHBsAb - HBsAg-HRP复合物，加入复合物，加入TMB底物产生底物产生 显色反应，反之则无显色反应。显色反应，反之则无显色反应。 材料材料 1、 HBsAg包被酶标板包被酶标板 2、酶标抗原（、酶标抗原（HBsAg-HRP） 3、阳性对照（、阳性对照（ HBsAb+） 4、阴性对照（、阴性对照（ HBsAb-） 5、待测标本（血浆）、待测标本（血浆） 6、洗涤液、洗涤液 7、显色剂显色剂A+显色剂显色剂B（TM

14、B底物）底物） 8、终止液终止液 方法方法 1、在已包被抗原的酶标反应板的每孔中加入待测、在已包被抗原的酶标反应板的每孔中加入待测 标本标本50l，设阴性对照、阳性对照各两孔。孔内，设阴性对照、阳性对照各两孔。孔内 均加相应的试剂一滴。并设空白对照孔均加相应的试剂一滴。并设空白对照孔1孔。孔。 2、 每孔加入酶标抗原一滴（空白对照孔除外），每孔加入酶标抗原一滴（空白对照孔除外）， 充分混匀，封板，充分混匀，封板，37孵育孵育30分钟。分钟。 3、洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置、洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5 秒，甩干，重复五次后拍干。秒，甩干，重复五次后拍干。 4、 每孔

15、加入显色剂每孔加入显色剂A、显色剂显色剂B各一滴，充分混各一滴，充分混 匀，封板，匀，封板，37孵育孵育15分钟。（蓝绿色）分钟。（蓝绿色） 5、每孔加入终止液一滴，混匀。（黄色）、每孔加入终止液一滴，混匀。（黄色） 6、观察各孔颜色变化。、观察各孔颜色变化。 思考题：为什么标记一种抗抗体能检测多对抗原抗体系统？思考题：为什么标记一种抗抗体能检测多对抗原抗体系统？ 附：乙肝病毒（附：乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV） 抗原抗原： 抗体抗体 1、表面、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（抗原（HBeAg） HBe

16、Ab 两对半：两对半： HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb HBV-Ag、Ab检测结果临床分析检测结果临床分析 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb + - - - - HBV感染感染/无症状携带者无症状携带者 + - + - - 急性急性/慢性乙肝慢性乙肝/无症状携带者无症状携带者 + - + - + 急性急性/慢性乙肝（传染性强，慢性乙肝（传染性强， 大三阳）大三阳） + - - + + 急性感染趋向恢复（小三阳）急性感染趋向恢复（小三阳） - + - + + 既往感染恢复期既往感染恢复期 - + - - + 既往感染恢复期既往感染恢复期 -

17、- - + - 既往感染或既往感染或“窗口期窗口期” - + - - - 既往感染或接种过疫苗既往感染或接种过疫苗 1 2 3 4 5 实验五实验五 凋亡细胞的凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳分琼脂糖凝胶电泳分 析析 【原理】【原理】 本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠 胸腺淋巴细胞在地塞米松诱导下细胞的胸腺淋巴细胞在地塞米松诱导下细胞的 凋亡现象。凋亡现象。 细胞在凋亡过程中有一系列特征性的形细胞在凋亡过程中有一系列特征性的形 态学的改变，其中最重要和最具有特征态学的改变，其中最重要和最具有特征 性的改变是性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切依赖性的核

18、酸内切 酶的激活而导致染色质酶的激活而导致染色质DNA在核小体连在核小体连 接部位断裂，降解为接部位断裂，降解为180200 bp的片段的片段 或其整倍数的片段，通过琼脂糖凝胶电或其整倍数的片段，通过琼脂糖凝胶电 泳可形成典型的泳可形成典型的“梯状带梯状带”。 【材料】【材料】 昆明小鼠昆明小鼠 RPMI-1640培养基培养基 小牛血清小牛血清 地塞米松地塞米松 基因组基因组DNA抽提试剂盒抽提试剂盒 10 mg/ml RNA酶酶 TE缓冲液缓冲液(pH 8.0) 50TAE电泳缓冲液电泳缓冲液 DNA ladder分子量标准品分子量标准品 6凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 眼科剪、眼科镊、不锈

19、钢网、眼科剪、眼科镊、不锈钢网、250目尼龙滤布目尼龙滤布 、台式高速离心机、恒温水浴、琼脂糖凝胶电、台式高速离心机、恒温水浴、琼脂糖凝胶电 泳装置、紫外透射仪等泳装置、紫外透射仪等 【方法】【方法】 一、一、1琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备 称取称取1g琼脂糖粉溶于琼脂糖粉溶于100ml 1TAE缓冲缓冲 液中，隔水煮沸溶解液中，隔水煮沸溶解(或微波炉中溶解）。或微波炉中溶解）。 取取15ml上述上述1琼脂糖制成凝胶板备用。琼脂糖制成凝胶板备用。 二、胸腺细胞的制备：二、胸腺细胞的制备： 眼球摘除放血颈椎脱臼处死小鼠，无菌眼球摘除放血颈椎脱臼处死小鼠，无菌 条件下取胸腺，置入含条件下取胸腺

20、，置入含5%小牛血清的预小牛血清的预 冷冷RPMI-1640培养液中，先用不锈钢网培养液中，先用不锈钢网 研磨，再将研磨好的细胞悬液用研磨，再将研磨好的细胞悬液用250目尼目尼 龙滤布过滤，龙滤布过滤，1000 rpm离心离心4 min，调整调整 细胞浓度为细胞浓度为1x107/ml。取上述取上述1x107/ml浓浓 度的胸腺细胞加入终浓度为度的胸腺细胞加入终浓度为1x10 5 M的 的 地塞米松，培养地塞米松，培养5 h即为凋亡阳性细胞，即为凋亡阳性细胞， 不加地塞米松为对照组。不加地塞米松为对照组。（去上清，沉（去上清，沉 淀细胞加淀细胞加1ml 1640 混匀备用）。混匀备用）。 三、小

21、鼠胸腺细胞三、小鼠胸腺细胞DNA快速提取快速提取 小鼠胸腺细胞（细胞浓度107/ml） （诱导组和未诱导组） EP管 (1.5ml) 弃上清 充分混匀后， 55 温浴 20分钟。 12000转/分，10秒 20ml A液和 100ml L液 加入10l3MNaAc和 1250lB液充分振荡混 匀后离心12000转3分钟 期间颠倒EP管五次 移取700ml至吸附柱中,静 止1分钟，离心30s。弃去 收集管中的液体，重复上 述操作。 加入600lW液离 心30s。弃去收集 管中的液体，重复 上述操作，再离心 1次 将吸附柱移入一个干净的EP管中(1.5ml)中。在吸 附膜的中央加入50ml T液，

22、静置1分钟后， 12000 转，离心1分钟。取出EP管(其中便是收集的DNA) 20 保存、备用。 一.细胞裂解阶段(L液=裂解液,RNaseA/蛋白酶K=A液) 二.结合DNA阶段(B=结合缓 冲液)三.漂洗阶段(漂洗缓冲液=W液) 四.洗脱阶段(洗脱缓冲液=T液) 四、电泳：四、电泳： 吸取吸取10 l/20 l DNA与与2 l /4 l上样缓上样缓 冲液混匀冲液混匀, 加到加到1琼脂糖凝胶的样本孔琼脂糖凝胶的样本孔 中，同时滴加标准分子量中，同时滴加标准分子量DNA于样本孔于样本孔 中，将上样端置负极端，室温，恒流中，将上样端置负极端，室温，恒流 75mA，电泳电泳1小时。小时。 五、

23、观察：五、观察： 电泳结束后，从电泳槽中取出琼脂糖凝电泳结束后，从电泳槽中取出琼脂糖凝 胶，置于含胶，置于含0.4 g/ml溴化乙锭的染色液溴化乙锭的染色液 中浸泡中浸泡510分钟。最后在紫外灯下观察分钟。最后在紫外灯下观察 实验结果。实验结果。 【结果结果】 加地塞米松培养的胸腺细胞加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后电泳后 呈典型的呈典型的“阶梯状阶梯状”条带，与标准分子条带，与标准分子 量量DNA参照物比较，为多倍的参照物比较，为多倍的180200 bp DNA片断。未加地塞米松培养的胸腺片断。未加地塞米松培养的胸腺 细胞，细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照无类似改变。细胞坏死对照 的

24、的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。电泳呈现弥漫的片状图谱。 地塞米松诱导小鼠地塞米松诱导小鼠 胸腺细胞凋亡胸腺细胞凋亡 1： DNA marker; 2-3：细胞坏死对照细胞坏死对照 4-6：细胞凋亡；：细胞凋亡； 7： 正常细胞对照正常细胞对照 1 2 3 4 5 6 7 方法方法 1、无菌采集静脉血、无菌采集静脉血2-3ml，注入盛有肝素的抗，注入盛有肝素的抗 凝试管中，混匀。凝试管中，混匀。 2、吸取淋巴细胞分层液、吸取淋巴细胞分层液3ml加入离心管中，再加入离心管中，再 将稀释抗凝血液将稀释抗凝血液2ml（剩余的抗凝血离心取血剩余的抗凝血离心取血 浆作检测浆作检测HBsAb用用)小心沿管壁小心沿管壁加至分层液上加至分层液上 ，应注意，应注意保持两者界面清晰。（关键）保持两者界面清晰。（关键） 3、室温、室温2000rmin离心离心20min。管内可分为四管内可分为四 层。层。 4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞，、用毛细吸管轻轻