白色链霉菌PL3-6菌株产聚赖氨酸发酵条件研究

1、2008届毕业生毕业论文题 目: 白色链霉菌PL3-6菌株产聚赖氨酸发酵条件研究 院系名称： 生物工程 专业班级： 生物工程0402班 学生姓名： 赵爱霞 学 号： 20044850427 指导教师： 惠明、田青 教师职称： 副教授、助教 2008年 06月 01日III摘 要-聚赖氨酸(-Poly-L-Lysine)是由微生物发酵合成的一种由赖氨酸单体通过-酞胺键形成的多肤。-PL 具有优良的抑菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、热稳定性高等特点。采用正交实验对筛选的一株白色链霉菌Streptomyces albulus PL3-6 发酵产-聚赖氨酸

2、(-PL) 的培养基成分进行了优化。结果表明，该菌株产-PL 的优化培养基为:葡萄糖 3.0 gL-1、酵母粉 0.5 gL- 1、(N H4)2SO4 1.2 gL- 1、KH2 PO4 0.20gL-1、 K2HPO4 0.12 gL-1、MgSO47H2O 0.05 gL- 1、FeSO47H2O 0.003 gL- 1、ZnSO47H2O 0.008 gL- 1。在优化培养基下，-PL 摇瓶产量达到4.05 gL- 1 ，比优化前提高了25 %。采用 D152 弱酸性阳离子交换树脂(H型)对发酵法生产的-聚赖氨酸进行了分离提取。参考文献设计了合理的工艺流程。离心分离发酵(pH3.2 )

3、，调节滤液的pH值到8.5，过滤除去沉淀。滤液通过D152 离子交换柱(H型)，用水和0.2 N 醋酸洗涤，用0.1N 的盐酸洗脱。用1N的NaOH 调节洗脱液的pH 值到6.5，加入活性炭脱色后浓缩到小体积。加入乙醇和乙醚的混合物(体积比2:1)后，析出白色晶体。关键词： -聚赖氨酸 白色链霉菌 发酵条件 提取 离子交换Title The study on ferment condition of Streptomyces albulus PL3-6 produced -PL Abstract-Poly-L-Lysine is comprised of lysine linked by am

4、ide bond through microbial fermentation. It has excellent antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, yeast and some kinds of viruses. In additional -Poly-L-Lysine is soluble and attractive heat stable. The fermentation medium of Streptomyces albulus producing -poly-L-Ly

5、sine was optimized by orthogonal experiments. The optimal medium consisted of 3.0 gL- 1 glucose, 0.5 gL- 1 yeast extract, 1.2 gL-1 (NH4)2SO4， 0.20 gL-1 KH2PO4, 0.12 gL-1 K2HPO4, 0.05 gL-1 MgSO47H2O, 0.003 gL-1 FeSO47H2O and 0.008 gL-1 ZnSO47H2O. The yield of -PL reached 4.05 gL-1with optimal medium,

6、 which increased 25% compared to initial medium. The separation and extraction of -Poly-L-Lysine from fermentation liquid by using weak acid anion-exchange resin D152 .The culture broth (pH3.2) was filtered and the filtrate was adjusted to pH8.5. Then, the precipitate formed was removed by filtratio

7、n. The filtrate was applied on a column of weak acid anion-exchange resin D152 (H+-from) and washed with 0.2 N acetic acid and water, successively. The substance was eluted with 0.1N hydrochloric acid. The eluate was neutralized with 1N sodium hydroxide and decolorized with active charcoal, and then

8、 evaporated to a small volume .The substance was precipitated as a white powder by addition of an ethanol and ether (2:1) mixture. Keywords: -Poly-L-Lysine; Streptomyces albulus; ferment condition; extraction ion exchange resins目 次1 引言 11.1 -聚赖氨酸 11.2 物理和化学性质 11.3 聚赖氨酸的发酵生产 21.4 研究价值 32 材料与方法 52.1 材

9、料 52.1.1 菌种 52.1.2 试剂 62.1.3 相关溶液及其配制 62.1.4 实验仪器 72.2 方法72.2.1 菌种的分离与纯化 72.2.2 培养方法 82.2.3 分析方法 82.2.4 提取方法 92.2.5 验证方法 93 结果与讨论103.1 -PL标准曲线的绘制 103.2 碳氮源优化实验 103.3 无机盐优化实验 123.4 -PL的提取 143.4.1 发酵液的预处理 143.4.2 离子交换树脂的预处理 153.4.3 离子交换提取 163.4.4 发酵液的紫外吸收波长的测定 163.4.5 -聚赖氨酸组成定性分析 17结论 18致谢 19参考文献20河南工

10、业大学 毕业设计（论文）1 引言随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，对食品品质提出了更高的要求，除了食品的营养、感官和外观包装外，食品的食用安全性更为人们所关注。由于食品的特殊性，对其防腐保鲜一直是食品研究中的重要方面。长期以来，由于受到经济环境和开发水平的制约，几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期。化学防腐剂如果超剂量使用会产生累积毒素和致癌作用，存在局限性。因此，安全、广谱、高效及经济实用的天然食品防腐剂的开发和生产成为食品防腐领域发展的趋势和要求。微生物食品防腐剂是天然防腐剂中的一大类，其是指通过微生物发酵的方法，从发酵液中提取分离得到有抑菌作用的物质，主要为多肤类物

11、质。目前，国际上批准使用的微生物食品防腐剂仅有乳酸链球菌素(Nisin)和纳他霉素(Natamycin)。我国分别于1990年和1996年批准上述两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜。另外，-聚赖氨酸也是一种抑菌效果明显的微生物食品防腐剂，其在日本应用广泛，在我国的研究才刚刚起步。由于这三种微生物防腐剂安全无毒、抑菌作用强，因此具有广阔的应用前景。11 -聚赖氨酸1977年日本学者S.shima和H.sakai1从放线菌培养过滤液中提取出一种含有2530个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过-梭基和-氨基形成的酞胺键连接而成，故称为-多聚赖氨酸(-PL)。实际上多聚赖氨酸的

12、合成是早在1947年由K.L.Eprain首先完成的2但是化学法合成的聚赖氨酸为型，其赖氨酸残基之间的酞胺键是由-氨基和-梭基缩合而成，研究也证明了-PL比-聚赖氨酸抑菌活性差且有毒性，因此目前在国际市场上。-聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了-多聚赖氨酸3。12 物理和化学性质-聚赖氨酸是一种含有2530个赖氨酸残基的同型单体聚合物多肽。赖氨酸残基通过-羧基和-氨基形成的酰胺键连接4。具有高抑菌活性-聚赖氨酸的分子量在36004300之间，当分子量低于1300时，-聚赖氨酸失去抑菌活性。红外光谱分析表明: -聚赖氨酸在16801640cm-1和15801520cm-1有强吸收峰5。H-NH-C

13、H2-CH2-CH2-CH2-CH-CO n-OH-聚赖氨酸结构式 NH2-聚赖氨酸带正电荷，可以和阴离子物质发生结合；没有固定的熔点，250以上开始软化分解；易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙醋、乙醚等有机溶剂；能够承受一般食品加工过程中的热处理，热稳定性高，120加热10min 仍具有抑菌活性17，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染；-聚赖氨酸经6N HCl 酸解24h后，测其赖氨酸的旋光度为23.8，表明每个残基上携带1mol HCl和水6。-PL抑菌的最适pH 58，也就是说其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性，而在酸性和碱性条件下，抑菌效果不太理想。可能由于聚赖氨酸作为赖氨酸的聚合

14、物，在酸性和碱性条件下易分解7。-PL 作为一种浓缩胶质溶液的交联剂，它的效力对pH和胶质分布有依赖性。在胶质中，阳离子电荷与阴离子缩氨酸聚合物的平衡导致了胶体的不透明性和最终导致网络结构的崩溃。在pH接近中性的时候，L-聚赖氨酸可以作为一种有效的胶质网络交联剂8。13 聚赖氨酸的发酵生产最初用野生的S . albulus 346进行发酵的研究中，-PL在最优化的培养基中的积累浓度是0.5 g/L。在发酵过程中，-PL 的最大积累浓度开始于pH 值6.0。当细胞生长达到稳定状态，培养基pH 值的降低是-PL 生产的关键(pH值3.05.0)。在发酵过程中，在培养基中添加L-赖氨酸对-PL 的生

15、产没有影响后，Shima 等发现给静止的细胞中添加葡萄糖和硫酸铵作为培养基，且在酸性pH 值的条件下，-PL的积累量可达45 g/ L 。-PL在pH 值5.06.0时产量迅速下降，说明S . albulus 中含有-PL降解酶。为了提高-PL 的生产力，Hiraki等在S .albulus 346 中筛选出对S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸(Glycine) 有抵抗力的变种。在野生种346中，L-赖氨酸会导致天冬氨酸激酶合成的部分抑制，这种酶是L-赖氨酸生物合成的关键酶，而甘氨酸可以抑制这种酶的活性。S-2-氨乙基半胱氨酸是L-赖氨酸的类似物，在2 mg/mL S-2-氨乙基半胱氨酸存在的情况

16、下， S . albulus 346 的生长不会被抑制；进一步增加甘氨酸到1 mg/mL会抑制其生长。在对S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸耐受性的菌种中，90% 是-PL的高产菌。其中之一(11011A)在测试管中的最大生产量是2.11 mg/mL ，是野生种346 的10倍。这个变种有很高的天冬氨酸激酶活性。在3 L摇瓶发酵罐中，以pH控制、葡萄糖和硫酸铵流加补料的方法， S . aLbuLus11011A在120 h 内靠吸收葡萄糖的收益可达20 mg/ mL (8.9%) 。Kahar 等论证了利用S . albulus 410 生产-PL 中严格控制pH值和葡萄糖浓度的重要性9。在-PL

17、 发酵生产中，培养基的pH 值通常会从最初的6. 8 降到36 h 后的4.2，然后96 h 内逐渐降到3.2。在pH 值低于4.2后，-PL开始逐渐在培养基中积累，所以在-PL的生产中严格控制pH 值是有必要的。pH值的控制分2个阶段，第1阶段为菌体的生长阶段，pH 值大于5.0 (培养过程pH值自然下降，当低于5.0时，用氨水调节) ；第2阶段为产物积累阶段，pH 值控制在4.0。在发酵过程中， 发酵液的葡萄糖浓度控制在10 g/L ，当葡萄糖浓度低于10 g/L 时，流加碳源和氮源(含有80%葡萄糖和8%硫酸铵的培养基) ，使葡萄糖浓度维持在10 g/L(一般在48 h后) ，经过47

18、d 的发酵，-PL的产率最高达48.3 g/L。迄今为止-聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化，年销售量为1000 t。但在我国还处于实验室阶段，小试和中试采用易操作的分批发酵。14 研究价值随着人们对食品安全性的认识和要求的逐步提高，化学防腐剂受到严峻挑战，食品防霉防腐剂的天然化已成为今后的发展趋势。天然防霉防腐剂是近年来国内外倡导、开发和寻求的新型产品，开发抗菌性强、安全无毒的天然防霉防腐剂已成为各国科技工作者的研究热点。它不但对人体健康无害，有的还具有一定的营养价值，是今后开发的方向。目前，国外食品防腐剂行业已相当成熟，开发出了数十种天然食品防腐剂，建立了完备的法规。国内对天然食品防腐

19、剂的研究起步较晚，目前尚属初级阶段，为适应市场需求，国内学者也做了大量的工作。21世纪是绿色的世纪，是追求食品安全与可持续发展的世纪。因此，开发绿色食品、有机食品成为提高经济效益，增加市场竞争力，提高人民生活质量的重要举措。随着人民生活水平的进一步提高，天然食品防腐剂在食品加工保藏过程中将被广泛使用。生物技术的飞速发展，为开发、应用天然食品防腐剂开辟了一条崭新的途径。至今-PL 发酵生产的研究已历经几十年，目前虽然-PL 发酵生产已在日本实现工业化，-PL 作为一种天然、无毒、可生物降解的聚氨基酸，不仅在食品工业有广泛的应用，而且其在医药、环保、农业中的应用也将不断拓开。-聚赖氨酸在目前的日本

20、添加剂目录表中属于一种天然添加剂，1989年日本窒素公司首先用生物技术方法工业化生产聚赖氨酸，同年，日本在添加剂目录表中把-PL归属于一种天然添加剂，并允许使用。以后韩国也允许作为食品添加剂使用。在美国和欧洲，主要是使用山梨酸作为防腐剂，但自2003年7月10日FDA 收到日本窒素公司的申请后，目前已正式批准(GRAS Notice NoGRN 000135)该公司生产的的-PL 作为天然食品添加剂。该公司还将逐步把-PL的应用拓展至纤维、化妆品及其他货品，甚至把-PL 作为抗菌材料用于厨房及浴室用具中。国内对-聚赖氨酸的应用处于研发阶段，有关- PL在医药和基因芯片领域的应用研究开展得较多，

21、在食品方面目前尚未列入使用卫生标准。因此，-聚赖氨酸的研究及食品防腐剂的应用具有广阔的前景和发展空间，- PL 独特的物理化学性质可以应用到除了食品工业以外的其他很多领域，所以将来-PL 会有巨大的需求。今后的研究重点是筛选到产聚赖氨酸的菌株，对其进行改造，大幅度提高产量；并加强基础研究，揭示其抑菌机理，同时加强应用研究。2 材料与方法21 材料2.1.1 菌种白色链霉菌（Streptomyces albulus） 实验室保藏菌株。2.1.2 试剂药品名称生产厂商无水葡萄糖中国派尼化学试剂厂郑州(NH4)2SO4天津市化学试剂三厂酵母膏北京双旋微生物培养基制品厂蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂

22、牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司ZnSO47H2O洛阳市化学试剂厂FeSO47H2O上海第二钢铁厂MgSO47H2O洛阳市化学试剂厂NaH2PO4洛阳市化学试剂厂Na2HPO4天津市科密欧化学试剂开发中心KH2PO4天津市科密欧化学试剂开发中心K2HPO4天津市科密欧化学试剂开发中心甲基橙天津市化学试剂一厂盐酸洛阳市化学试剂厂醋酸开封化学试剂总厂乙醇洛阳吴华化学试剂有限公司磷酸开封开化有限公司NaOH天津市化学试剂厂丙酮洛阳市化学试剂厂甲醛洛阳市化学试剂厂茚三酮天津科密欧化学试剂开发中心-聚赖氨酸SIGMA(固体标准品)2.1.3 相关溶液及其配制10（1）0.1 mol/L 磷酸钠缓冲溶

23、液的配置取62.5 mL 的0.2 mol/L 的NaH2PO4 溶液和37.5 mL 的0.2 mol/L 的Na2HPO4 混合即得到0.1 mol/L 磷酸钠缓冲溶液。（2）1 mmol/L 甲基橙溶液 称取0.0327 g 甲基橙定容于100 mL 磷酸钠缓冲溶液中。（3）1 mol/L 和0.1mol/L 盐酸溶液 1 mol/LHCl：量取90 mL 的36%-37%浓度的HCl 定容于1000 mL 蒸馏水中。 0.1 mol/LHCl：量取9 mL 的36%-37%浓度的HCl 定容于1000 mL 蒸馏水中。（4）1 N和5 N的NaOH溶液 1 N 的NaOH 溶液：称取4

24、0 g NaOH 固体定容于1000 mL 蒸馏水中。 5 N 的NaOH 溶液：称取10 g NaOH 固体定容于50 mL 蒸馏水中。（5）0.2 N 的醋酸溶液 称取质量分数大于99.5% 的浓醋酸定容与500 mL 蒸馏水中。（6）0.1% 磷酸溶液 量取质量分数为85% 的磷酸定容于1000 mL 蒸馏水中。2.1.4 实验仪器仪器名称生产厂商723N可见分光光度计 上海申安医疗器械厂752紫外光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司PYXDHS40X50BS 电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂GZXGFMBS1（9053A）电热鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂LD5-2A型低速离心机北京医

25、用离心机厂pHSJ-4A型数字PH计上海雷磁仪器厂LDZX50FB立式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂TGL16C台式离心机上海安亭科学仪器厂FA12048电子天平上海精密科技有限公司THZ-30恒温培养摇床上海-恒科学仪器有限公司超净工作台苏州净化设备有限公司SWCJ2F型双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂2.1.5 培养基11（1）高氏一号培养基可溶性淀粉 2 g，K2HPO4 0.05 g，MgSO4 7H2O 0.05 g，KNO3 0.1 g，NaCL 0.05 g，FeSO4 7H2O 0.001 g，琼脂 1.5 g，水 1000mL，

26、PH值 7.2 （2）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 2 g， 蛋白胨 10 g， NaCl 5 g，琼脂 15 g， 水1000 mL（3）贝特纳培养基葡萄糖 1 g/L， ，蛋白胨 0.2 g/L，酵母膏 0.1 g/L，琼脂 1.5 g/L，pH值 7.5（4）种子培养基 葡萄糖 5 g/L，酵母膏 0.5 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，KH2PO4 0.6 g/L， K2HPO4 0.8 g/L，MgSO4 7H2O 0.02 g/L，FeSO4 7H2O 0.02 g/L，pH值 6.8（5） 发酵培养基 基本组成与种子培养基相同。在培养基碳氮源的优化实验中 ，碳氮源含量按照正交

27、实验设计进行 ，无机盐的含量同种子培养基。在碳氮源最有条件下进行无机盐优化，在无机盐的优化实验中，碳氮源按正交实验设计最有条件配制。22 方法2.2.1 菌种的分离与纯化11（1） 保藏菌种的活化与稀释涂布取一环实验室保藏菌株按10-1用无菌水进行适当的稀释，吸取不同浓度的菌悬0.1 mL装有15 mL左右的贝特纳培养基的平板上，30倒置培养34 d。再挑取菌落较大的进行划线分离。如图1：（2） 抑菌圈法 图1 聚赖氨酸划线平板 底层铺10 mL下层培养基，将培养好的单菌落点接至培养基上，30下培养2 d，将上层培养基冷却至50左右，加入10%敏感菌培养液摇匀，去10 mL铺于底层培养基上。点

28、解菌落间距要足够大，以免抑菌圈互相重叠。将平板于30恒温培养24 h，出现边缘清晰的抑菌圈。（3） 单菌落分离纯化 挑选抑菌圈较大的菌落转接到贝特纳斜面培养基，30恒温培养7 d，待斜面完全被孢子覆盖，冰箱（4）保存备用。如图2：2.2.2 培养方法 （1） 种子培养液的制备 图 PL3-6菌株斜面 取1环斜面菌种于装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，于30、220rmin-1菌培养24 h得到种子培养液。如图3、图4：图 种子培养液 图 培养后的种子液（2） 发酵培养 以1%的接种量将种子液转接到装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在30，220 rmin-1条件下培

29、养72 h。如图5、图6： 图 发酵培养基图 发酵完成液2.2.3 分析方法（1） 发酵液pH的测定 将发酵液4000 r/min离心8 min，上清液采用pHSJ-4型pH计测定。（2） -PL产量的测定发酵液中-PL产量的测定： 采用Itzhaki方法12 测定-PL产量。测定前先将从水中重结晶的甲基橙溶于pH值为6.6的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液配制成浓度为1 mmol/L的溶液。将1.9 mL的磷酸盐缓冲液和2.0 mL、1 mmol/L甲基橙溶液依次加入到0.1 mL发酵液上清液中，所得混合物在30条件下剧烈震荡，反应30 min；然后4000 r/min离心15 min，除去产

30、生的-PL与甲基橙形成的复合物。取上清液1 mL用磷酸钠缓冲液稀释至50 mL，在465 nm处测吸光度。2.2.4 提取方法 采用 D152弱酸性阳离子交换树脂(H型)对发酵法生产的-聚赖氨酸进行了分离提取。2.2.5 验证方法13 对发酵液进行紫外扫描，测定其最大吸收波长；通过水解洗脱浓缩液中的聚赖氨酸经行纸层析，与标准赖氨酸的迁移率作对比。3 结果与讨论3.1 -PL标准曲线的绘制聚赖氨酸的溴化物，甲基橙从水中重结晶，并干燥至恒重，实验前将两者溶于pH值为6.6的0.1mol/L的磷酸钠缓冲液中。取2 mL不同浓度的聚赖氨酸溶液（0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.

31、8 mg/L、1 mg/L）与2 mL、1 mmol/L的甲基橙混合，混合液震荡反应30 min，4000 r/min条件下离心15 min，取上清液稀释至50 mL，以磷酸缓冲液为空白样，在465 nm下测其吸光度A465。 表1 不同浓度下-PL的吸光度 Tab.1 The absorbency of -PL in different concentration X0.3850.3050.2440.1690.114Y0.20.40.60.81 3.2 碳氮源优化实验 在Streptomyces albulus PL3-6产聚赖氨酸的单因素实验结果上，选取葡萄糖量、(NH4)2SO4含量和酵

32、母膏含量三个因素，利用正交表L9(34)进行3因素3水平正交实验。实验设计、结果和分析如表1表3所示。表2 碳氮源优化正交实验L9 (34)因素水平表(g/L)Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment L9 (34) foroptimizing carbon and nitrogen sources (g/L)水平A.葡萄糖含量B.(NH4)2SO4含量酵母膏含量1233.05.07.00.40.81.20.30.50.7表3 碳氮源优化正交实验L9 (34)结果Tab.3 Results of orthogonal experimen

33、t L9 (34) for optimizing carbon and nitrogen sources试验号ABCY-PL产量/(g/L)1234 56789K1K2K3RKi21112223339.6109.3418.0900.506245.0541231231238.5208.7559.7660.415244.6151232313128.5609.5338.9480.325244.2182.8873.2603.4633.1533.0053.1832.4802.4903.120Yi = 27.041Yi 2 = 82.143以n表示试验的总次数，a、b、c表示A、B、C三因素每个水平的重复

34、试验次数，则有 n=9, a=3，b=3，c=3.先计算 2=(xi)2=27.0412=81.246，QA= (Ki2)- 2 =245.054-81.246=0.439，QB= (Ki2)- 2 =244.615-81.246=0.292，QC= (Ki2)- 2 =244.218-81.246=0.160.而 Q总=Xi2- 2=82.143-81.246=0.897于是 误差：Qe= Q总-（ QA + QB + QC）=0.897-（0.439+0.292+0.160）=0.006每个因素的自由度为水平数减1，Q总的自由度为n-1，列出方差分析表如下：表4 碳氮源优化正交实验L9 (

35、34)方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment L9 (34) foroptimizing carbon and nitrogen sources方差来源平均和自由度均方差F值显著性ABC误总和0.4390.2920.1600.0060.897222280.21950.14600.08000.003073.16748.66726.6发67* * * *注：查F临界值表 F0.1( 2，2 ) = 9.00 F0.05( 2，2 ) = 19.00 F0.01(2，2 ) = 99.00 根据F值大小可知决定碳氮因素对实验影响从大到

36、小的顺序为：A B C再根据每个因素k值大小可以看出，碳氮源含量最佳水平为A1B3C2，即葡萄糖 3.0 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、酵母膏 0.5 g/L 。从表4方差分析可以看出，葡萄糖含量对聚赖氨酸产量影响较显著，(NH4)2SO4含量和酵母膏对聚赖氨酸产量影响显著。从在这个实验可以看出碳氮源对聚赖氨酸的生产非常重要，但由于实验室条件的影响，实验结果有很大的误差。3.3 无机盐优化实验以碳氮源最优条件为基础，在Streptomyces albulus PL3-6产聚赖氨酸的单因素实验基础上，选取无机盐KH2PO4含量、K2HPO4含量、ZnSO47H2O含量、等五个因素，

37、利用正交表L8(27)经行5个因素两个水平正交试验。实验设计、结果和分析如表5、表6所示。表5 无机盐优化正交试验L8 (27)水平表(g/L)Tab.5 Factors and Levels of orthogonal experiment L8 (27) for optimizing inorganic salts (g/L)水平A. KH2PO4B. K2HPO4C. MgSO47H2OD. FeSO47H2OE.ZnSO47H2O120.100.200.080.120.050.100.0030.0060.0040.008 表6 无机盐优化正交实验L8 (27)Tab.6 Results

38、 of orthogonal experiment L8 (27) for optimizing inorganic salts实验号ABCDEY-PL产量/(g/L)12345678K1K2RKi 1111222213.55214.9241.372406.382 1122112213.72014.7561.036405.978 1212121214.71213.7640.948405.891 1212212 114.35814.1180.240405.470 1221122113.80214.6740.872405.821 3.2413.2693.8323.2103.6383.5724.00

39、13.713Yi = 28.476Yi2 =101.967表7 无机盐优化正交实验L8(27)方差分析Tab.7 Variance analysis of orthogonal experiment L8 (27) for optimizing inorganic salts方差来源平均和自由度均方差F值显著性ABCDE误总和0.23550.13450.11280.00750.09530.02140.371611111270.23550.13450.11280.00750.09530.010722.0112.5710.540.708.91* *注：查F临界值表 F0.05(1，2) = 18.

40、51 F0.1(1，2) = 8.53从表6中可以看出，无机盐优化的最佳水平为A2B2C1D1E2，即KH2PO4 0.20g/L、K2HPO4 0.12 g/L、MgSO47H2O 0.05 g/L、FeSO47H2O 0.003 g/L、ZnSO47H2O 0.008 g/L根据表7中F值的大小可知决定因素对实验影响从大到小的顺序为：A B C E D从表7中可以看出，KH2PO4含量、K2HPO4含量、MgSO47H2O含量对-PL产量影响显著，ZnSO47H2O含量对-PL产量有一定影响，FeSO47H2O含量对-PL产量没影响。3.4 -PL的提取3.4.1 发酵液的预处理微生物发酵

41、液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质以及微生物的各种代谢产物。从微生物发酵液中提取发酵产品的第一个步骤就是预处理，其目的不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒，还着眼于除去可溶性杂质和改变滤液的性质，以利用提取和精制中常用的各后继工序。各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。发酵结束后的发酵液中除了目的产物-聚赖氨酸，还含有大量的菌体、残糖、其他代谢副产物，以及Ca2+、Mg2+、Fe2+等金属离子。这些物质对采用离

42、子交换树脂提取都将产生很大的影响，降低提取收率，所以发酵液必须经过预处理。（1） 离心分离14固液分离是生物产品工厂中经常遇到的重要单元操作。培养基、发酵液、某些中间产品和半成品等都需要进行固液分离。工业上常用的固液分离的方法是离心和过滤。目前在实验室条件下，发酵液体积小时离心较过滤快速、方便，如果发酵残余体积大，离心就显得效率低下，发酵工业中固液分离常采用的方法是过滤，如选用板框过滤机过滤。实验中，发酵罐中发酵液的体积大约为1 L，所以采用离心分离。刚下罐的发酵液为棕黄色粘稠液体，离心除去菌体后得到澄清透明的发酵液。离心速率为4000 rpm，离心时间为15min。（2） 发酵液的相对纯化

43、发酵液中主要的无机离子有Ca2+、M g2+、Fe2+等，高价无机离子的存在，在采用离子交换法提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。可溶性蛋白质的存在，不仅在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，而且在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清15蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性，变性蛋白质的溶解度较小，可采用使蛋白质变性的方法沉淀除去可溶性的蛋白质。使蛋白质变性的方法很多，最常用的是加热法，加热不仅使蛋白质变性，同时降低液体粘度，提高过滤速率。但加热法只适合于对热比较稳定的目的产物。使蛋白质变性的其他方法有:大幅度调节pH值，常将发酵液pH值调

44、至偏酸性范围(pH23)或在碱性范围内(pH89 )使蛋白质凝固。本实验采用将发酵液调到碱性范围内(pH89 )，使蛋白质变性凝固后过滤除去16。综合决定：除去发酵液中的高价无机离子；离子交换适合的上柱pH值；蛋白质变性沉淀适合的pH值，用5 N的NaOH调节发酵液pH值到8.5。调节pH值以后，发酵液中产生大量白色絮状沉淀，静置一段时间，过滤除去产生的沉淀。3.4.2 离子交换树脂的预处理离子交换树脂在使用前都必须经过一系列的处理才能投入使用。一般是经过去杂、过筛、用水漂洗，除去破碎、空心的树脂，洗去泥土和杂质，再用酒精洗去可能吸附的少量有机物质。然后进入化学处理:用810倍体积1 mol/

45、L的HCI处理2-4小时(经常搅拌)，用水反复洗至中性;然后用1 mol/L的NaOH浸泡24h(经常搅拌)，用水反复洗至中性;再用810倍体积1 mol/L的HCl的浸泡24h，用水洗至中性备用。这个过程是酸-碱-酸，得到的是氢型树脂。对于强酸型树脂，如果想得到钠型树脂，则处理的过程为碱-酸-碱;对阴离子树脂，碱-酸-碱处理，得到的是经型树脂，酸-碱-酸处理则得到的是氯型树脂，最后的一步称为转型。在蛋白质或酶的离子交换分离过程中，要求树脂有一定的pH值，因此，在树脂转型后，应用相应pH值的缓冲溶液平衡一段时间才可以使用。3.4.3 离子交换提取11取50 mL 湿的D152树脂装填于1.6

46、cm 45 cm 的玻璃柱中, 置于铁架台上，通过恒流泵控制上柱液的流速为6 mL/min。待发酵液上柱完毕后，先用蒸馏水冲洗柱子，此阶段可加快流速。用0.2 N醋酸洗涤柱子，待洗涤完毕后，用0.1 N的盐酸洗脱，收集洗脱液，如图7所示。用1 N的NaOH溶液调节洗脱液的pH值到6.5，加入活性炭脱色液过滤后用旋转蒸发仪浓缩到小体积，后按体积比为2:1加入乙醇和乙醚的混合物，析出白色晶体，如图8所示。 图7离子交换脱色后的洗脱浓缩液 图8 提取物3.4.4 发酵液的紫外吸收波长的测定 测定用0.1%磷酸溶液配成的10 mg/ml -聚赖氨酸提取物，以磷酸溶液作对比， 经行紫外扫描，可以看出提取

47、的-聚赖氨酸提取物的最大吸收波长为192 nm，如图9所示，但杂峰比较多，说明提取物中含有杂质比较多，需进一步纯化精制，但由于时间各种原因所限制，没进一步纯化精制。 图9 -聚赖氨酸紫外吸收波长3.4.5 -聚赖氨酸组成定性分析量取1 mL的离子交换洗脱浓缩液放到带有塞子的试管中，加如6 mol/L的盐酸溶液3 mL，在110烘箱中水解24 h，过滤并洗涤滤渣。将滤液和标准L-赖氨酸样品点样于层析纸上，展开剂为正丁醇:甲酸:水= 15:3:2 (V /V) ,显色剂为茚三酮的丙酮溶液，其结果如下图所示： 图9样品水解后的纸层析图结 论通过在各个单因素实验基础上，选取了培养基诸成分多个水平进行白色链霉菌产-PL发酵条件优化，通过正交实验获得了优化条件：葡萄糖 3.0 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、酵母膏 0.5 g/L、KH2PO4 0.20 g/L、K2HPO4 0.12 g/L、MgSO47H2O 0.05 g/L、FeSO47H2O 0.003 g/L、ZnSO47H2O 0.008 g/L，-PL 摇瓶产量达到4.05 gL- 1 ，比优化前提高了25 %。另外，采用D152弱酸性阳离子交换树脂(H型)从发酵液