病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)

1、实践二病毒血凝和血凝抑制试验-（以新城疫为例）实践目的：1 掌握血凝（HA和血凝抑制（HI）试验的原理2 掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集， 此即为 红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体 （免疫血清）所抑制, 即为红细胞凝集抑制试验。实践内容：1. 红细胞凝集试验（HA试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在 V形微量反应板上进行。（1）首先用

2、微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴（25卩I）。（2）用微量移液器取病毒抗原液25卩1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取251液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25 1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:21:2048，第12孔为红细胞对照。（3）再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液1滴（25卩I）。（4）在振荡器上振荡混匀约 I2分钟，再置37 C作用15分钟后观察结果。（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。表1鸡新城疫血凝效价（HA）的测定术式（微量法）孔号123456789101112病毒稀释倍数1:21:41:

3、81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照生理盐水病毒液2525卩125125卩25马 25可2525 g!25125 ”125g1 225gl 4 25g1、25g1 Q525125 卩1弃去1%红细胞悬液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作置振荡器上混匀12分钟，放37 C静置15分钟结果例示#+-#表示100%完全凝集+表示50%凝集-表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝

4、集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使100%红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液 25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4 = 32倍的稀释液。2.红细胞凝集抑制试验(HI试验)有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25卩I)，从第1孔到第10孔。第1I孔加稀释液2滴(50卩I)。(2)以微量移液器取被检血清25卩I，放入第1孔，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再

5、吸取25卩1液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第 10孔,最后第十孔吸取25 1液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:21:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。(3) 每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25卩I)至第10孔，第1I孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。(4) 置振荡器上振荡I2分钟后，放37 C静置20分钟。(5) 每孔再加入1.0 %红细胞悬浮液1滴(25卩I)放振荡器上振荡I2分钟混匀，置37C,15分钟后判定结果。表2鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)孔号123456789101112被检血清稀1:21:41:81:161

6、:321:641:121:251:511:10红细包抗原释倍数86224对照对照生理盐水25卩125 g125 gl25 gl25gl25 g25gl25gl25gl25glL150 gl25 gl被检血清25 glJgl卜85glS5gl、5gl05 g、5gl25gl25gl、glfglJ_JJ-JJJ弃掉4单位病毒液25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl振荡器上振荡12分钟，放37 C作用20分钟1%!细胞悬液25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 gl25 g

7、l25 gl振荡器上振荡12分钟，放137 C作用15分钟结果例示-+#-#注： -表示不凝集、+表示部分凝集、#表示完全凝集。结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的细细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉 淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾 斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清 的红细胞凝集抑制效价为 1：128 或 HI 效价为 7（10g2） 。 结果分析：（1）一般认为鸡的

8、免疫临界水平为 1:8（ 成年）或1:16（ 雏鸡） ，随地区不同而稍有差异。（2）鸡血清 HI 抗体效价高于 1:16 时可适当推迟新城疫免疫的时间， HI 抗体效价在 1:16 以下，须进行新城疫疫苗接疫种， 在新城疫流行的地区或鸡场， 鸡的免疫临界水平应稍提高。（3）鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的 HI抗体效价（吨2）的平均值表示的。如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价（吨2）为8的有3份样品，为7的有5份样品, 为 6的有 2份样品，它们的平均值为：8 X 3 + 7 X 5+ 6X 2/3 + 5+ 2= 7.1平均水平在4（10g2）以上，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中 HI

9、 抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根 据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。（4）大型养鸡场， 每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1 一 0.5 ，小型鸡群，抽样 率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为 2.0 。（5）鸡群接种新城疫疫苗后， 经23周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上， 表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI 抗体效价无明显提高，表示免疫失败。作业：1 每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。2根据血凝价将新城疫病毒稀释成 4 个单位病毒液， 每三位学生做一个血凝抑制试验， 检

10、测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3回答问题：（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？（ 2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？（ 3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？实践三 病毒血凝和血凝抑制试验 - （以新城疫为例）（一）实践目的：1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。（二）实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此 即红细胞凝集现象。 这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素， 能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体 结合， 发生红细胞凝集现象。 可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，

11、 并可以测 定病毒的效价。1、 血凝试验： 常多用感染鸡胚液进行， 凝集价可达 1:160-1:640 也可采用急性病例的组但凝集性能不够稳定，故通常 取血后加抗凝剂或脱纤维， 置于 1%生理盐水悬液， 即可应用。 操织浸出液， 但凝集价较低。本病毒可凝集许多动物的红细胞， 作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉， 离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后， 将浓缩的红细胞配成 作方法见实习指导。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。2、 血凝抑制试验： 单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断， 因为还有其它病原也能引 起红细胞凝集， 如引起慢性呼吸道病的禽败血支

12、原体。 所以需用已知的抗血清作血凝抑制试 验，以鉴别病毒。也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体， 而得明确的诊断。但不适于急 性病例，通常要在感染后的 5-10 天，或出现呼吸症状后的 2 天，血清中的抗体到一定水 平，就可用试管法。（三）主要器材与药品器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头 5-5.5号、感染鸡胚，微量移液器 1套，V型、96 孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，药品： 病毒：鸡新城疫弱毒疫苗； 0.85%生理盐水、 1%红细胞浑悬液、血清、 4单位病毒。 标准阳性血清；浓缩抗原； 0.5%红细胞浑悬液；被检血清； pH7.0 7.2 磷酸缓冲盐稀释 液；pH7.0 7.2

13、磷酸缓冲盐稀释液： 氯化钠（GB1266-77） 170g ;磷酸二氢钾（GB1274-77）13.6g ;氢氧化钠（GB629-77）3.0g ;蒸馏水1000ml;高压灭菌，4保存，使用是作 20倍 稀释。鸡 1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3%柠檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤 3次，每次以 3000r/min 离心 10分钟，将血浆、白细胞 等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。被检血清： 每群鸡随机采 20 30 份血样，分离血清。采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至68cm长。将管一端烧融封

14、口， 待凝固析出血清后以 1000r/min 离心 5 分钟， 剪断塑料管， 将血清倒入一块塑料板小 孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0 C 保存。（四）实践方法操作方法4.1 微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加 磷酸缓冲盐 稀释液 50ul ，共滴四排。4.1.2 吸取 1:5 稀释抗原 滴加于第一列孔，每孔 50ul ，然后由左至右顺序倍比稀释至第 11 列孔，再从第 11 孔各吸取 50ul 弃之。最后一列不加抗原作对照。4.1.3 于每孔加入 0.5%红细胞悬液 50ul。4.1.4 置微型振荡器上振荡 1 分钟，或手持血凝板绕圆圈混

15、匀。4.1.5 放室温下（ 1820oC） 3040 分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原 最大稀释度为该 抗原的血凝滴度 。每次四排重复，以几何平均值表示结果。4.1.6计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。抗原应稀释倍数=血凝滴度/4 .（B1）材料123h910L12生理益 水2 b齒0500 SO J:51% 虹细胞：505W5050505050稀釋 倍数121161/32丄皿1 1281/2561/5121 10241 2048詰果凝礙礙不不不车凝上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22 C室温中静置，自第15分钟

16、开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片，呈伞状铺于管底，不凝集的红细胞沉积于管底，呈一小圆点，将板倾斜，可以看 到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动（五）结果观察：1 首先观察对照孔，红细胞应无凝集。2 观察实验孔+全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。+大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小 红点。+约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小 圆点。+只有少数红细

17、胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆 盘周围。-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。病毒血凝呈现的不同程度凝集强度凝集效价：能使红细胞呈 +凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如上述第7孔为+，则该病毒悬液效价为 1: 128,即病毒稀释到1: 128时，每50卩I 中含一个血凝单位的病毒。凝集孔数越高，病毒凝集效价越高4单位病毒：血凝试验（HA ）测出病毒的 HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻 备用。病毒的血凝实验（HA ）结果分析病毒的血凝实验（HA）结果分析（五）鸡新城疫微量血凝抑制试验5.2.1先取稀释液50ul，

18、加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入312孔，每孔50ul，第二孔加浓度为 8个血凝单位的抗原 50ul。5.2.2吸被检血清50ul于第1孔（血清对照）中，挤压混匀后吸50ul于第2孔，依次倍比稀 释至12孔，最后弃去50 ul.5.2.3置室温（18 20C ）下作用20分钟.5.2.4滴加50ul 0.5%红细胞悬液于各孔中，振荡混合后，室温下静置30 40分钟，判定结果 5.2.5每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照.结果判定1在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制 滴度.2若有10%上的鸡出现11（log 2）以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染.3若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在 4（log 2 ）的鸡群保护率为 50%右；在4（log 2） 以下的保护率达 90%-100%;在4（log 2）以下的 非免疫鸡群保护率约为9