PCR扩增原理及操作

1、PCR 扩增反应的操作第一节 PCR 扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（ PCR ）的基本构成PCR 是聚合酶链式反应的简称， 指在引物指导下由酶催化的对特定模板 （克隆或基因组 DNA ） 的扩增反应，是模拟体内 DNA 复制过程，在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于 DNA 作图、 DNA 测序、分子系统遗传学等。PCR基本原理是以单链 DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下， 用酶进行互补链的延伸， 多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。 在微量离心 管中，加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序

2、列分别互补的两个引物、 适量的缓冲液、 微量的 DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对， 形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在 Taq DNA 聚合酶的催化下，以 dNTP 为原 料，引物沿5 3方向延伸，形成新的 DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复 改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩 增。因此 PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶

3、在适当温度下催化 DNA 链延伸合成（见 图）。1模板 DNA 的变性模板DNA加热到9095 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合， 为下轮反应作准备。变性温度与 DNA 中 G-C 含量有关， G-C 间由三个氢 键连接， 而 A-T 间只有两个氢键相连， 所以 G-C 含量较高的模板， 其解链温度相对要高些。 故 PCR 中 DNA 变性需要的温度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、 G-C 含量高低等均有关。对于 高 G-C 含量的模板 DNA 在实验中需添加一定量二甲基亚砜 （DMSO ），并且在 PCR 循环中起始阶 段热变性温度可

4、以采用 97C，时间适当延长，即所谓的热启动。2模板 DNA 与引物的退火将反应混合物温度降低至 3765C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般 要求引物的浓度大大高于模板 DNA 的浓度， 并由于引物的长度显著短于模板的长度， 因此在退火 时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间 一般为12min。3引物的延伸DNA 模板 -引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理，合成一条

5、与模板 DNA 链互补的新链。重复循环变性 -退火 -延伸三 过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要 的时间取决于模板 DNA的长度。在72C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为4060个碱基 /秒。经过一轮“变性 -退火 -延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合 成的 DNA 都可以起模板作用，因此每一轮循环以后， DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环 需24min, 次PCR经过3040次循环，约23h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当 引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平

6、台效应”，即靶DNA 产物的浓度不再增加。PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y =（1 + X） n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数， X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表 循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来 是不可避

7、免的。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个 引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不 一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其 5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引 物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止 点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短

8、产物片段”。 不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽 略不计，这使得 PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnininnI 95C I II i, i i ：11 | r变性退火延伸图 PCR的反应历程二、PCR 反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1引物引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理 论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做

9、引物，利用 PCR 就 可将模板 DNA 在体外大量扩增。引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配) 。引物的选择将决定 PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的 Tm 值这个和扩增物产量有关的 重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR 中也能识别cDNA 或基因组模板。 引物设计也极大的影响扩增产量： 若使用设计粗糙的引物， 产物将很少甚至 没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了

10、 好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。(1) 引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为 15-30bp，常用的是1827bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成 Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对； 引物过长时又会造成 Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74 C，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。( 2)引物碱基构成引物的 G+C

11、 含量以 4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC 含量不能相差太大。 其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T )估计引物的Tm值，则有效引物的 Tm为5580C，其Tm值最好接近72 C以使复性条件最佳。引物中四种 碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在 G+C富集序列区错误引发。( 3)引物二级结构 引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模

12、 板的结合从而影响引物效率。对于引物的3末端形成的二聚体，应控制其AG大于-5.0 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物 中间或 5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以 3端或近 3端对引物 -模板结合影 响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大 的关系。应尽量避免 3末端有发卡结构的引物。( 4)引物 3端序列引物 3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后 5 到6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3末端的错配过多， 通过降低反应的退火温

13、度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物 3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补， 尤其是在 3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3末端的稳定性由引物 3末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的AG。?G值是指 DNA 双链形成所需的自由能， 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性， 此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用3端?G值较低（绝对值不超过 9）,负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高。引物的 3端的？

14、 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第 3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他 3个碱基，因此应当避免在引物的 3端使用碱基 A。（5）引物的5端弓I物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响 扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；弓I入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两 个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期

15、的克隆实验，特别是在用于表达研究的目 的基因的克隆工作中。（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。2 .酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热 DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq DNA 聚合酶是一个单亚基，分子量为94 000 Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，无3-5的外切核酸酶活力，会在 3末端不依赖模板加入 1个脱氧核苷酸（通常为 A，故PCR产 物克隆中有与之匹配的 T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为1

16、0-410-5。此酶的 发现使PCR广泛的被应用。此酶具有以下特点：（1） 耐高温，在70C下反应2小时后其残留活性在 90%以上，在93C下反应2小时后其残 留活性是仍能保持 60%，而在95C下反应2小时后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。3） 一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达 40kb;有在常温条件下即可应用的常温 PCR聚合酶；还有针对不同实 验对象的酶等。一典型的PCR反应约需的酶量为 2.5u （总

17、反应体积为504时），浓度过高可引起非特异性扩 增，浓度过低则合成产物量减少。3. dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去 生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5,小量分装，-20 C冰冻保存。多次冻融会使 dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50200心。1/1，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种 浓度不同于其它几种时 （偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR产物的产量。dNTP 能

18、与Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。4 .模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的 DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶 解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K能水解消化蛋白质，特别是与 DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其 它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于 PCR反应。一般临床检测标本， 可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用 于

19、PCR扩增。模板DNA投入量对于细菌基因组 DNA 般在110ng/川，实验中模板浓度常常需要优化，般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。5. Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/l时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 一般厂商提供的Taq DNA聚合酶 均有相应的缓冲液，而 Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无Mg2+的

20、缓冲液，在PCR反应体系中添加一定量的 Mg 2+。三、PCR反应特点PCR反应具有以下特点：1 强特异性PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与模板 DNA特异性的结合；（2）碱基配对原则；（3）Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则 的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。 再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2 高灵敏度

21、PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到6微克（乜=10- g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU （空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为 3个细菌。3 快速简便PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性-退火-延伸反应，反应一般在24小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量 PCR仪）则可全程监测 PCR反应的结果，故耗时将更短。4 .低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均

22、可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。第二节 PCR扩增反应的实施一、PCR反应的条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数。1 温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双 链DNA在9095C变性，再迅速冷却至 4060C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温 至7075C，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 对于较短靶基因（长度为100 300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性,65 C左右退火与延伸（此温

23、度 Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。( 1)变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93 C94C lmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为 高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性， 就会导致 PCR 失败。(2) 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40C60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱 基组成及其浓度

24、，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值(解链温度) =4(G+C) 2(A+T)复性温度=Tm值-(510 C )在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec,足以使引物与模板之间完全结合。(3) 延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 C, 150核苷酸/S/酶分子；7 0C, 60核苷酸/S/酶分子；55C, 24核苷酸/S/酶分子；高于90C时，DNA合

25、成几乎不能进行。(4) PCR反应的延伸温度一般选择在7075C之间，常用温度为 72C,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min ;扩增10kb需延伸至15min。 延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。2循环次数循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度，一般的循环次数 选在 30 40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性

26、扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能 得出正确的结论。 PCR 产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。1 凝胶电泳分析： PCR 产物电泳， EB 溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。 P CR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR,应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。( 1)琼脂糖凝胶电泳：通常应用1 2%的琼脂糖凝胶，供检测用。( 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳： 610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。2酶切分析：根据 PCR 产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳

27、分离后，获得符 合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。3分子杂交：分子杂交是检测 PCR 产物特异性的有力证据，也是检测 PCR 产物碱基突变的 有效方法。4Southern 印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链 (内部寡核苷酸)标记后做探针， 与 PCR 产物杂交。 此法既可作特异性鉴定， 又可以提高检测 PCR 产物的灵敏度， 还可知其分子量 及条带形状，主要用于科研。5斑点杂交：将 PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交， 观察有无着色斑点，主要用于 PCR 产物特异性鉴定及变异分析。6核酸序列分析：是检测 PCR

28、 产物特异性的最可靠方法。三、PCR 结果异常分析PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。1 假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有： 模板核酸的制备；引物的质量与特异性； 酶的质量及活性； PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。(1) 模板： 模板中含有杂蛋白质； 模板中含有Taq酶抑制剂； 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液

29、，其程序亦应固定不宜随意更改。(2) 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。(3) 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： 选定一个好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看 0D值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条

30、引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓 度。 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失 效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。(4) Mg 2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异 性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。(5) 反应体积的改变：通常进行 PCR扩增采用的体积为 20川、30川、50山或100出,用多大体 积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如20川后，再做大体积时， 一定要模索条件，否则容易失败。(6) 物理原因：变性对 PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板 的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度，这也是 PCR失败的原因之一。(7) 靶序列变异：如