实用pcr流程表

1、临床PCR佥验流程记录表检验日期： 检验项目：HBV-DNA 扩增仪中保存文件名 使用说明：严格按单一流向进行实验，即试剂准备区-标本制备区-扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；各项 工作执行后在相应项目前的方框内打“V”；本记录表最后归档保存在 PCF实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）生物安全柜的滤膜在使用有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格各区按消毒液配制 SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酉精，即用即配。打开通风设备操作者试剂准备区实验前

2、：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（28C）C； 冷冻室（-20 2C）C实验室温度 C （允许范围：1530C）；相对湿度： （允许范围：30%-70%）PCM剂来源：试剂厂家：口深圳匹基生物工程有限公司批号：检验项目：HBV-DNA本次实验用量：人份；剩余量：人份其他有关试剂配制：仪器设备使用： 离心机：正常 不正常；振荡器：正常不正常；生物安全柜： 口正常 口不正常实验后：口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理 SOP处理实验废弃物。操作

3、者检验日期：检验项目:HBV-DNA样本处理区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（28C）C； 冷冻室（-20 2C）C实验室温度 C （允许范围：1530C）；相对湿度： （允许范围：30%-70%）HBV-DNAH性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA!性室内质控物来源：批号：扩增位置：所处理的HBV-DN/标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置:19172533414957657381892101826344250586674829031119273543515967758391412

4、2028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：按乙型肝炎病毒 DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜： 正常 不正常；恒温金属浴：C；离心机：正常 不正常；振荡器：正常不正常；低温离心机：制冷：正常 不正常； 离心：正常不正常实验后： 口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理 SOP处理实验废弃物。口使

5、用后标本冷冻保存 3个月，以备复查。操作者扩增及产物分析区实验前：更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酉精或水擦拭）实验室温度 C （允许范围：1530C）；相对湿度： （允许范围：30%-70%）LightCycler 扩增仪操作：开机自检及运行正常；按LightCycler 操作使用SOP进行编程、参数设定HBV-DNA准曲线计算值：Slope 值：Intercept值：r2值：室内质控结果：阴性质控物结果： ;阳性质控物结果： 口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否 口是室内质控结果：阴性质控物结果： ;阳性质控物结果： 口填写室内质控记录

6、、质控图；是否失控：口否 口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）实验结果：见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断：有效 无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）实验后： 口按实验室清洁消毒 SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。按实验室废弃物处理 SOP处理实验废弃物。操作者1. 操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n二样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV 强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2 向上述离心管中分别加入 25ul 蛋白酶溶液。1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界

7、阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4 加入 200ul 新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡 15秒，充分混匀。 （注意： 不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中） 。1.2.5 56摄氏度温浴 15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.6 加入 250ul 无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡 15秒） 。在室温下静置 5分钟（ 15-25 摄氏度）。注意：如果环境温度超过 25 摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离 心，以去除管盖上的滴液。1.2.7 将 n 个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤 1.2.6 中的液体移入核酸提取柱 中。盖上盖子， 6000*g 离心 1 分

8、钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收 集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保 提取柱中无残余的液体）1.2.8 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul 洗液 1，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul 洗液 2，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分 钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.10 小心的打开核酸提取柱的盖子，加入 500ul 无水乙醇，盖上盖子， 6000*g 离心 1 分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集

9、管中。1.2.11 20000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子,56 摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。1.213将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul 洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离 心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在 2小时 内用于PCRT增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。2. 扩增试剂准备（PCF前准备区）从试剂盒中取出HCV RT-PC反应液、Enzyme Mix ,在室

10、温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n （n二样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测 试反应体系配制如下表：试剂HCV RT-PCR反应液En zyme Mix用量n *13uln *2ul计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。3. 加样（样本处理区）吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到 上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），

11、盖紧反应管管盖，连同Roche专用 金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细 管排放好放入荧光PCR测仪内，记录样本摆放顺序。4. RT-PCR反应（检测区）4.1 循环条件设置ProgramCyclesTemperatureIn cubati onTemperatureAcquisitAnal摄氏度Time(mi n:secTran siti onionysis)Rate(ModeMode摄氏度/sec）115030:0020NoneNone219515:0020NoneNone9500:0520NoneQua n3455000:3020Si ngle

12、tifi7200:2010Nonecation反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。4.2仪器检测通道选择选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。4.3样本的设定在扩增开始前条件设定时，将 HCV定量标准品设为“ Standard ”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“ Unknown”结果分析条件设定1. 对HCV勺曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。2. 分析方式选择Fit Points，基线调整选择 Arithmetic,阈值（threshold ）设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常 HCV阴性对照病毒

13、滴度 为O.OIU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1. 将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以 HCV定量标准品的浓度值为横坐 标，以其实际测得的外标 Ct 值为纵坐标给出标准曲线， 标准曲线的拟和度绝对值应大 于等于0.980,四个HCV定量标准品的Ct值都应38.0，否则视为定量结果无效。2. HCV阴性对照、空白对照 HCV RNA应为0.0IU/ml ； HCV强阳性对照HCV RNA应为 5.0E+05-1.0E+07IU/ml ； HCV临界阳性对照应为 1.0E+03-1.0E+05 IU/ml ;且 HCV阴 性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33,否则此次实 验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1. 检测样本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RN小于等于5.0E+07 IU/ml，测定结果有 效,可直接报告相应的浓度值。2. 检测样本中HCV RN大于5.0E+07 IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦 可将该样本用正常人血浆按 1 0倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测 定,测定结果应以稀释倍数进行校正。3. 检测样本中 0.0IU/ml 小于 HCV RNAJ、于 1.0E+03 IU/ml，且 HCV内对照（IC）的 Ct 值都应小于等于 33