ELISA检测技术

1、.,1,酶联免疫吸附试验 (ELISA),ELISA技术简介,ELISA的基本原理,ELISA的类型和方法,ELISA方法注意事项和应用,.,2,酶联免疫吸附试验（ELISA）,酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原-抗体反应的特异性和等比例性，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附（包被）在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入相应的酶底物后发生颜色反应，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反

2、应，通过颜色反应的深浅检测标本中相应抗体或抗原含量的检测技术 。,.,3,ELISA的发展概况,自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前，ELISA检测技术在科学研究、疾病诊断、检验检疫、环境监测等诸多领域广

3、泛应用。,.,4,ELISA的基本原理,酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过分光光度计进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。,基本原理,.,5,ELISA试剂盒的组成,完整的ELISA试剂

4、盒通常包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）参考标准品（定量试剂盒）及其稀释液；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液（通常为浓缩液，用前按比例稀释）；（7）反应终止液； （8）封口膜若干、说明书一份。,.,6,酶标板,.,7,ELISA常用酶类,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP),DH2+ H2O2 D + H2O上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。,常用底物： 1. 邻苯二胺(OPD)，产物为橙红色（492nm检测）； 2. 四甲基联苯胺(TMB)，产物为蓝

5、色，酸性条件下变为 黄色（450nm检测）。,反应终止液：HCl或H2SO4溶液。,.,8,碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP),常用底物： 1. 对硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，产物为黄色的对硝基酚 （405nm检测）； 2. 发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于荧光测定，灵敏度高于显色底物的方法。,反应终止液：NaOH 溶液。,.,9,ELISA所需仪器设备,恒温箱,洗板机,酶标仪,.,10,ELISA的类型和方法,半定量ELISA试验,定量ELISA试验,试验目的,试验性质,间接法,双抗夹心法 (直接夹心法),BAS-ELISA,双夹心法 (间接夹心法),

6、竞争法ELISA,直接法,.,11,直接法ELISA是将酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量（见后图） 。该方法可用于检测抗体或抗原。,直接法ELISA,优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。,缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。 需制备各种酶标抗原或抗体。,.,12,间接法ELISA,间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗和抗原

7、的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。 该方法可用于抗体检测，是目前检测抗体最常用的ELISA方法。,优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体; 2. 制备方便，价格便宜。,.,13,双抗夹心法ELISA,双抗夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出捕获的抗原量，本方法也称为直接夹心法（见后图） 。 该方法可用于抗原检测，例如细胞因子、激素、蛋白质、细菌、病毒等，是目前检测抗原最常用的ELISA方法。,优点: 1. 适用范围广，无需制备特殊的酶标抗体。 2. 制备方便

8、，价格便宜。,.,14,双夹心法ELISA,双夹心法是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，然后用未标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-未标记抗体复合物；再应用酶标二抗和抗体-抗原-未标记抗体复合物结合，形成抗体-抗原-未标记抗体-酶标二抗复合物，也称为间接夹心法（见后图）。 该方法可用于抗原检测，例如蛋白质、病原体等。,优点: 1. 灵敏度高。 2. 制备方便，无需制备特殊的酶标抗体。,缺点: 实验操作较复杂。,.,15,.,16,BAS-ELISA,BAS-ELISA即生物素-亲和素系统（biotin avidin system, BAS）ELISA法：是先将抗体包被在酶标板上，用

9、于捕获抗原，然后用生物素（biotin）标记的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-生物素标记抗体复合物，再依次加入亲和素、酶标记生物素（或直接加入酶标记的亲和素），最后加底物显色。 生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法具有信号放大功能（特点）。 该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。,.,17,BAS-ELISA实验原理,.,18,竞争法ELISA,竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品

10、溶液和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。,.,

11、19,测定孔,酶标记物,底物溶液,对照孔,酶标记物,底物溶液,参考液(不含抗原),样本(含抗原),竞争法ELISA实验原理,.,20,半定量ELISA试验,.,21,间接法检测血清HBsAb含量,设计加板次序 (空孔、阴、阳),加板 (阴、阳、样),37, 30min,加酶标抗体 (空孔除外),洗涤3次，拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加终止液 (空孔除外),避光,上机检测、结果判定 (空孔调零),37, 30min,洗涤3次，拍干,.,22,双抗夹心法检测血清IL-2含量,设计加板次序 (空孔、阴、阳、标准),加板 (阴、阳、标准、样),37, 30min,加酶标抗体 (空孔除外),洗涤3次, 拍干,加底物溶液 (空孔除外),37, 10-30min,加终止液 (空孔除外),避光,上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零),从标准曲线上 读取样品含量,37, 30min,洗涤3次, 拍干,.,23,ELISA试验中的注意事项,必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验试剂盒的质量；,待测样品应设立双复孔或三复孔；,半定量（或定性）ELISA中结果判断依据通常为： OD样/OD阴2.1时为阳性结果，2.1时为阴性；,酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性；,定量ELISA中每一