蛋白质结构与功能的NMR研究

1、蛋白质分子溶液结构与功能的NMR研究部分,蛋白质的NMR研究内容,蛋白质溶液三级结构的测定 蛋白质的构象变化 蛋白质与靶分子（靶蛋白、核酸、配体小分子、药物）的相互作用 蛋白质的动态特性 蛋白质的折叠机制和折叠路径,一. 确定生物分子的溶液三维结构,蛋白质分子：天然态蛋白质、突变体蛋白质、部分折叠态蛋白质、非天然态蛋白质。 核酸分子：DNA、RNA 蛋白质复合物：蛋白质与蛋白质复合物、蛋白质与DNA或RNA复合物，蛋白质与药物小分子复合物、蛋白质与拮抗剂小分子复合物,蛋白质溶液三维结构确定的技术基础,高场核磁共振波谱仪的发展 500MHz600 MHz750 MHz800 MHz900 MHz

2、 多维（二维、三维、四维）核磁共振实验技术的发展 梯度场多维NMR脉冲程序 TROSY类型多维NMR脉冲程序 取向介质中蛋白质残余偶极相互作用检测方法 处理和解析多维核磁共振数据的软件开发研究,蛋白质溶液三维结构确定的重要性,蛋白质结构与功能关系研究的重要部分 蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础 可在结构基础上研究蛋白质发挥生理功能的活性部位 可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系 蛋白质动态特性与结构特性密切相关,二. 天然态蛋白质结构功能研究,蛋白质与药物小分子、拮抗剂等结合的活性部位确定 蛋白质发挥生理功能时活性部位的构象变化 蛋白质动态特性与功能的关系 蛋白质折叠/去折叠 蛋

3、白质稳定性 蛋白质在水溶液中多构象的平衡 蛋白质肽键的顺反异构与功能关系 蛋白质中的水分子,Research: 3D solution structure NOE, 3JN, 3J , Hydrogen-bond binding site NOE, , 3JN, 3J , Hydrogen-bond conformational change NOE, , 3JN, 3J , Hydrogen-bond folding/unfolding NOE, , H , 3JN backbone dynamics 15N-T1, 15N-T2, 15N-NOE, H/D exchange protein

4、-protein interaction NOE, , H protein-nucleic acid interaction NOE, , H,三. 蛋白质复合物相互作用的研究,蛋白质与蛋白质相互作用研究 蛋白质与核酸相互作用研究 蛋白质与拮抗剂和底物小分子相互作用 靶蛋白质与药物小分子相互作用,Research: conformation of the complex conformation of protein conformation of substrate, peptide, - binding site on protein binding interface Methodolo

5、gy: isotope labeling of protein isotope labeling of nucleic acid isotope labeling of peptide hetero-nuclear filtering NMR experiments docking by using software package,四. 非天然态蛋白质的研究 蛋白质片段的溶液构象 变性剂作用下蛋白质的动态特性变化 脲变性、酸变性蛋白质的特性与残存结构 五. 膜蛋白质分子的研究 膜蛋白质与膜脂分子相互作用,Study of non-native protein,Research: refold

6、ing process of protein dynamic properties of non-native protein residual structures of protein Problems: extensive overlap of peaks reducing the NOEs averaged over an ensemble of conformations broad line widths Methodology: isotope labeling of protein site-directed mutagenesis hydrogen-exchange puls

7、e labeling,多维NMR研究蛋白质溶液三维空间结构及功能关系,NMR 方法是确定蛋白质溶液三维结构的唯一有效手段,确定蛋白质溶液三维结构的重要性： 蛋白质结构与功能关系研究的重要部分 蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础 是研究蛋白质发挥生理功能的活性部位的必要条件 可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系 蛋白质动态特性与结构特性密切相关,1) 多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构的基础,蛋白质的结构信息 20种氨基酸：氨基酸由H、C、N、O、S等元素组成，提供链长和键角信息。 蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸残基序列。提供蛋白质的氨基酸组分，排列顺序以及各类原子数。 蛋白质的

8、二级结构：蛋白质分子不同肽段主链原子在三维空间中不同的排列规律性，表现为-螺旋，-片层、转角和环等基本结构单元。在不同二级结构单元的肽段中，肽键的二面角不同，主链氢原子间的相对位置或距离不同。 蛋白质的三级结构：蛋白质的二级结构单元在三维空间中的相对排列，提供原子间的远程距离信息,核磁共振波谱信息 化学位移：氨基酸的H、C原子的核磁共振峰在-螺旋与链中的化学位移分布呈现规律性的差异。 J-偶合：反映了肽键的二面角(，)大小。 - 螺旋和片层二级结构单元中的J-偶合数值范围不同。 NOE：核自旋之间的偶极偶极相互作用产生的交叉驰豫导致NOE现象，在两个核之间的距离小于5时可以观察到NOE信号,波

9、谱信息与结构信息的对应 化学位移可以直接用作判别形成螺旋、片层的氨基酸残基肽段的实验依据。 J耦合可用以直接确定肽键的二面角，。 NOE信号强度与两个核之间的距离六次方成反比。由NOE强度可以确定两个原子之间的距离，在螺旋与片层中氢原子之间的NOE强度呈现不同的特征。可用以精确地测定螺旋与片层。由主链原子间远程相互作用提供的NOE可以精确地测定蛋白质分子的三级折叠,多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构的流程图,NMR研究蛋白质中存在的问题,同核(1H-1H)NMR在确定蛋白质溶液的结构方面，可以获得小于100个残基的小蛋白的溶液结构，在准确度方面类似于2.0-2.5 分辨率的晶体结构 随着蛋白

10、质分子量的进一步提高，由于化学位移的重叠或简并，使得在(1H-1H)NMR方法中所使用的自旋系统识别和序列识别方法不再完全有效 其次是随着分子量增加，谱线变宽，因而使得较难利用建立在小的同核耦合(耦合常数12Hz)之上的一些位移相关实验,金黄色葡萄球菌核酸酶 920 1H resonances in 10 ppm 722 13C resonances in 185 ppm 143 15N resonances in 220 ppm,小蛋白和大蛋白二维同核NMR谱的比较,BmP02(28个残基) ADR6(115个残基) 部分NOESY谱,增加NMR波谱的维数,从二维扩展到四维可提高谱图分辨率,

11、二维三维四维,1H/13C/15N多维核磁共振波谱示意图,单键异核耦合用于磁化强度传递,磁化矢量之间的传递是建立不同自旋之间联系的方式，也是多维核磁共振方法的基础。 溶液核磁共振方法中常见的传递方式，一是通过跨键连接，也就是标量耦合进行传递，如同核传递，异核传递；二是通过跨空间相互作用。 对于1H 的同核传递通过3JHH，一般取1/(2*3JHH) ，约3080ms 。 对于脂肪链13C 同核传递通过1JCC 传递，一般取3/(4*1JCC)，约1020ms。 对于1H-13C 的异核传递通过1JCH，一般取0.8/1JCH，约6.7ms,蛋白质分子稳定同位素(13C, 15N)标记,2) 蛋

12、白质样品的准备,需要对白质分子进行稳定同位素(13C, 15N)标记 for protein of M. W. up to 20 kDa 50% 2H labeling 95% ul 15N labeling 98% ul 13C labeling 95% ul 15N, 98% ul 13C labeling for protein of M. W. 40 kDa or higher 50% 2H, 95% ul 15N, 98% ul 13C labeling,3) 基本的多维NMR实验,Multi-dimensional NMR pulse program: for backbone r

13、esonance assignments for side-chain resonance assignments for NOE measurements for J-coupling constant measurements for H/D exchange experiments for 15N relaxation experiments,三维异核实验脉冲程序： 用于氨基酸残基序列(主链)指认的脉冲程序 3D1H-15N-13C HNCA, HNCO, HN(CA)CO, HN(CO)CA, HN(CA)HA, HCACO, HCA(CO)N 用于氨基酸残基的侧链指认的脉冲程序 3D

14、1H-15N-13C CBCA(CO)NH, HNCACB, HBHA(CBCACO)NH, CC(CO)NH 3D1H-13C HCCH-COSY, HCCH-TOCSY,CBCA(CO)NH脉冲程序:顶部是磁化矢量传递路径，紧挨其下的I3, I2等对应于不同的磁性核。 = 10；= y；1 = y；2 = x, -x频率分辨（TPPI或者States-TPPI）；3 = x；4 = x；5 = 2(x), 2(-x)； rec = x, 2(-x), x,4) 三维NMR波谱分析,共振峰指认 共振谱峰分布范围 1H ：10ppm；13C：185ppm；15N：220ppm 两种指认策略,三

15、维异核波谱谱峰指认(基于J耦合的共振峰指认) : 首先完成氨基酸序列(主链)指认 然后进行氨基酸残基的侧链(自旋系统)指认,SNase的HNCA 谱,SNase 的HNCA和HNCO波谱,Ssh10b CBCA(CO)NH/HNCACB谱 K64-K68条带图。从左到右，每个残 基的CBCA(CO)NH和HNCACB谱图依次相邻。HNCACB谱上浅色的峰是 负峰,Ssh10b HNCO/HN(CA)CO谱 K64-K68条带图。从左到右，每个残基的HNCO谱和HN(CA)CO谱依次相邻,Ssh10b的HBHA(CO)NH和HBHANH实验，S79G82条带图。从左到右， 每个残基的HBHA(C

16、O)NH和HBHANH谱图依次相邻。标的是1H，标 的是1H。在谱上，1H和1H符号相反,Ssh10b残基I76的CC(CO)NH和HCCH-TOCSY谱。 （A）CC(CO)NH实验的15N平面；（B）HCCH-TOCSY实验I76的侧链13C各个对应的1H-1H 平面,NOE共振峰指认 1H-15N NOESY-HSQC,蛋白质中常见二级结构单元典型的NOE相关性,Characteristics of secondary structural elements,1) - helix strong dNN (i, i+1) NOEs (continuous stretch) strong d

17、N(i, i) and dN(i+1, i) NOEs medium dN(i, i+3) NOEs dNN(i, i+2) NOEs d(i, i+3) NOEs weak or absent dN(i, i+1) NOEs,2) Anti-parallel pleated sheet strong NOEs: dN(i, i+1) medium NOEs: dNN(i-1, j+1) dNN(i+1, j-1) dN(i, j+1) dN(j, i+1) d(i, j) weak or absent NOEs: dNN(i, i+1,Anti-parallel pleated sheet图

18、例,3) Parallel pleated sheet strong NOEs: dN(i, i+1) medium NOEs: dN(i, j) or dN(j, i) weak or absent NOEs: dNN(i, i+1) No d(i, j); dNN(i-1, j+1); dNN(i+1, j-1) NOEs,4) Turns Reverse turn II: strong NOEs: dN(2, 3) 2. segmental labelling: discrete segments of the polypeptide chain are uniformly labell

19、ed; 3. Chemical-shift mapping or Differential chemical-shift mapping 检测底物小分子： Based on T2 and T1enhancement: the large differences in the rates of rotational and translational motions of a small molecule in the free state relative to when it is bound to a macromolecule 新的脉冲方法： SEA-TROSY: selects sol

20、vent-exposed amide protons in uniformly deuterated 15N-labelled proteins dissolved in H2O by magnetization transfer from H2O,二氢叶酸还原酶(DHPR,Met -13CH3 resonance region a. Chemical-shift mapping 方法： 绿色表示没有底物存在，蓝色表示存在底物类似物pyridine-2,6-dicarboxylate (PDC) b. Differential chemical-shift mapping方法： 蓝色表示结合P

21、DC，红色表示结合4-chloro-PDC,SEA-TROSY脉冲方法,Conventional 15N,1H-HSQC,15N,1H-TROSY,SEA-TROSY selects solvent-exposed 1HN,Methods based on T2 and T1enhancement,1. T2 (小分子) T2 (蛋白质) the resonance lines in the NMR spectra of small molecules are much narrower than those in the spectra of macromolecules. 2. T1 (小分子) transferred NOEs: small positive NOEs for free small ligand; negative NOEs for bound ligand,SAR (stru