天然药物化学 第十二章 天然药物活性成分的研究

1、第十二章 天然药物活性成分研究,一、从天然药物中开发新药的方法,1. 经过文献资料或民间用药的调研或通过现代药理学的筛选研究，发现某种动物、植物、矿物或微生物具有药用价值，然后将其开发成新药。,2. 已知某种成分或某类成分具有药用价值或已成为新药，根据动植物的亲缘关系，寻找含有这种或这类成分的动植物，进而将其开发成新药。,第一节 天然药物活性成分的研究途径和方法,3. 将临床疗效明确的经典方、经验方或经药效学研究具有开发价值的复方中药开发成新药，或将现有的药物改变剂型，如由口服液改为片剂、注射剂等。 采用这种形式开发的新药：有效成分不明确，药品的质量控制难度较大。但具有生产工艺不太复杂、成本较

2、低、比较符合我国国情等特点。,4. 搞清有效成分和有效部位的基础上，将有效部位开发成新药。因有效成分已明确或基本明确，故采用这种方法开发的新药具有药品的均一性、较易控制、临床疗效稳定、质量易于得到保证等特点。,5. 通过有效成分或生物活性成分的研究，从中发 现有药用价值的活性单体或潜在药用价值的活性单体 先导化合物。通过先导化合物构效关系的研究，发 现有药用价值的化合物。 先导化合物 有一定的生物活性，但因其活性 不够显著或毒副作用较大，无法将其开发成新药的具 有潜在药用价值的化合物。,研究天然药物新药的一般过程：,二、天然活性成分的筛选： 以活性为指标进行追踪 从天然药物或中药中分离活性化合

3、物时，多在确认供试样品的活性之后。 1.先选择简单易行、灵敏度高、可靠的活性测试方法作指导。 2.在分离的每一阶段对分离得到的各个部分进行活性定量评估，并追踪其中活性最强部分。 3.因为物质分离与活性分离同步进行，一般在最终阶段总能得到某种活性成分，发现新化合物的可能性也很大。,活性测试方法选择是活性追踪分离的关键 理想的体外活性测试方法应具有的特点： 简易、快速、不需特殊设备、方便、抗干扰性强、假 阳性和假阴性均较低、临床相关性强等优点。但在实际工作中理想的活性测试方法往往很难找到，只有综合分析考虑，根据实际情况、条件以及研究开发的课题选择较理想的活性测试方法。同时也要根据实践经验积累和科学

4、技术的发展，改进现有的一些活性测试方法和建立一些新的活性测试方法。,确保供试材料具有活性 在活性追踪分离之前: 要采用体内体外多种方法，多个指标对实验材料进行活性测试，其目的是再次确证实验材料的活性，确定有无进一步研究的价值； 为选择活性追踪分离所用的活性测试方法提供依据。 以下的流程是美国癌症研究中心（nci）用于筛选确 认植物或动物粗提取物抗肿瘤活性的改进方案。,植物粗提取物抗肿瘤活性的筛选方案,从天然药物中筛选追踪得到活性化合物只是一类创新药物研究的前期阶段。而且不少的天然活性化合物还存在一定的毒副作用或因含量太低，难以从天然原料中取材；或因结构过于复杂，合成也十分困难，故本身并无直接开

5、发利用前途。此时只能以它们为先导化合物，经过一系列的化学修饰或结构改造后，才能发现比较理想的活性化合物，并开发成为新药上市。,天然化合物的化学修饰或结构改造：,喜树碱,：抗癌活性，毒性大,喜树碱,10羟基喜树碱,秋水仙碱：具有抑制肿瘤作用，但毒性较大。经结构改造后仍保持较高的抗癌作用，毒性也较低，用于治疗乳腺癌。,三、天然药物化学成分的预试验,（一）预试验的目的和分类 系统预试验 单项预试验 （二）单项预试验 1、单项预试验溶液的制备 （1）水提取液 （2）中性醇提取液 （3）酸性醇提取物 （4）石油醚提取液,1.系统提取分离方法:是研究天然药物成分的初步提取分离方法。用极性从低到高的溶剂依次

6、提取。 石油醚油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类 氯仿或醋酸乙酯游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元 丙酮或乙醇、甲醇苷类、生物碱盐、鞣质等 水氨基酸、糖类、无机盐等 2.单体分离,四、天然药物化学成分的提取分离,天然药物中生物活性成分的研究方法,第二节 结构研究法,结构研究是天然药物化学的一项重要的研究内容。 合成西药：原料已知，反应条件一定时，事先可以预测得到产物的结构。 中药化学成分：未知因素很多，对于微量物质难以采用化学方法确定结构，主要靠波谱分析的方法解决。,一、化合物的纯度检查,检查纯度的方法： 外观、颜色、形态是否均一. 测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率

7、等. 如果可能是已知物，用已知结构的对照品进行对 照测定或测定它们的共熔点等. 薄层色谱、纸色谱（三种展开系统均呈单一斑点） 气相色谱、高效液相色谱.,二、结构研究的主要程序,对未知天然化合物的结构研究程序,三、结构研究中采用的主要方法,（一）确定分子式，计算不饱和度,1. 元素定量分析配合分子量测定 有机化合物的元素大多由c、h、o、n等组成，对组成元素的种类和比例的分析，可以通过元素分析的方法确定。分子量的测定方法目前最常用的是质谱法。 2. 同位素丰度比法 有机化合物的主要元素均由相对丰度比一定的同位素组成，且质量相差12。 3. 高分辨质谱法（hr-ms） 可将物质的质量精确测定到小数

8、点后3位，通过比较精确质量可区分分子量相同的不同化合物。,不饱和度的计算 u=/2/21 ：一价原子数 如h、x ：三价原子数，如n、p ：四价原子数，如c,作用： 用于确定分子量；求算分子式。 提供结构信息，推测未知物结构。 特点： 应用范围广，进行同位素及化合物分析。 分析速度快，可与色谱联用。 灵敏度高，样品用量少（只需5-10 g）,（二）质谱,（二）质谱,常用质谱技术及特点 电子轰击质谱（ei-ms，electron impact ionization） 场解析质谱（fd-ms，field desorption ionization） 快速原子轰击质谱（fab-ms，fast ato

9、m bombardment） 电喷雾质谱（esi-ms，electrospray ionization）,电子轰击质谱（ei-ms）：样品气化后，气态分子受一定能量的电子冲击，使分子电离或裂解产生各种阳离子。 场解析质谱（fd-ms）：试样稀液涂于钨丝上作阳极，对面加阴极，通高压，使电离。,样品需加热气化，离子化，得到m+ 难气化、易热解的成份测不到m+ 如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素,难气化、易热解的成份，可得到 分子离子相关峰：mh+、mna+、mk+ 逐个脱去糖基的碎片峰：mh-162+、mh-162-146+ 苷元的碎片离子相对少,快速原子轰击质谱（fab-ms）：离子枪发射

10、高能离子与另一中性粒子碰撞，交换电荷，形成高速中性粒子，与样品碰撞，使其电离。,难气化、易热解的成分，可得到 分子离子相关峰：mh+、mna+、mk+ 可得到苷元的碎片,电喷雾质谱（esi-ms）：强静电场使试样电离,难气化、易热解、大分子、小分子，均可得到 分子离子相关峰：mh+、mna+、mk+,（三）红外光谱（ir）,原理： 分子吸收红外线后引起化学键的振动或转动能级跃迁而形成的吸收谱图（4000625cm-1） 作用： 特征频率区（functional group region） 40001500 cm-1确定官能团类型 指纹区（fingerprint region） 1500600

11、cm-1构象、构型、取代模式等,特征基团区,指纹区,（四）紫外-可见吸收光谱,电子由基态跃迁至激发态（、n）在紫外可见光区引起的吸收谱图 测定范围：200700nm 之间 作用：对含有共轭双键、,-不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定有重要价值 特定的吸收谱特征骨架类型的判断 如：黄酮、香豆素、蒽醌 加诊断试剂前后谱图的规律性变化取代情况的推断 如：黄酮、香豆素,生色团：产生紫外吸收的不饱和基团，如c=c, c=o, o=n=o等； 助色团：其本身是饱和基团（常含有杂原子），它连到生色团上时，能使后者吸收波长变长或吸收强度增加，如-oh, -nh2, -cl等； 红移（red shift） ：由于

12、基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变长。 蓝移（blue shift）：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变短。,（四）紫外-可见吸收光谱,（五）核磁共振谱,1hnmr测定中通过化学位移（）、谱线的积分面积以及裂分情况（重峰数及偶合常数）可以提供分子中的1h的类型、数目及相邻原子或原子团的信息。 （1）化学位移（chemical shift ）：1h核因周围化学环境不同，其外围电子密度以及绕核旋转时产生的磁屏蔽效应也不同。不同类型的1h核磁共振信号将出现在不同的区域，据此可以进行识别。化学位移范围：在010 ppm。,1. 氢核磁共振(1h-nmr),具有磁距的原子核在高强度磁场作用下，可吸收

13、适宜频率的电磁辐射，而不同分子中原子核的化学环境不同， 将会有不同的共振频率，产生不同的共振谱。,特征质子的化学位移值,1,0,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,c3ch c2ch2 c-ch3 环烷烃,0.21.5,ch2ar ch2nr2 ch2s cch ch2c=o ch2=ch-ch3,1.73,ch2f ch2cl ch2br ch2i ch2o ch2no2,24.7,0.5(1)5.5,68.5,10.512,chcl3 (7.27),4.65.9,910,oh nh2 nh,cr2=ch-r,rcooh,rcho,常用溶剂的质子的化学位移值,d,（2）峰

14、面积：因为1hnmr谱上积分面积与分子中的总质子数相当，当分子式已知时，就可以算出每个信号所相当的1h数，积分值与氢的数目成正比。如乙醇的氢谱中ch3与ch2的谱峰积分值基本等与3:2。 （3）信号的裂分及偶合常数：已知磁不等同的两个或两组1h核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生分裂，表现不同裂分，如：s,d,t,q,m等。裂分间的距离为偶合常数（j，hz）用以表示相互干扰的强度，其大小取决于间隔键的距离。,（五）核磁共振谱,1. 氢核磁共振(1h-nmr),（五）核磁共振谱,与氢谱一样，核磁共振碳谱也是采用相对值来表示化学位移，通常使用四甲基硅烷（tms）作为13c化学位移的零点。

15、有机化合物的13c共振化学位移范围是0200ppm，碳谱的化学位移范围较氢谱广得多，能够提供更多的信息。,2. 核磁共振碳谱,（五）核磁共振谱,13c信号的化学位移：,脂肪碳：小于50 连杂原子碳（c-o，c-n，c-s）：50100 甲氧基碳（-och3）：55左右 糖端基碳：95105 芳香碳、烯碳：98160 连氧芳碳：140165 羰基碳：168220，具体：醛：190205；酮：195220；羧酸：170185；酯及内酯：165180；酰胺及内酰胺：165180,常见13cnmr谱有下面几种： 噪音去偶谱：采用宽频电磁辐射照射1h，使其对13c偶合全部消除，13c信号以单峰形式出现 选择氢核去偶谱:对某个氢核进行选择性照射，以消除其偶合影响，与之相关联的13c信号发生改变，根据峰的裂分变化情况，结合化学位移，可以推断分子中存在的片段结构。 dept法:通过改变照射1h核的脉冲宽度（）或设定不同的弛豫时间，使不同类型的13c在图谱上呈现单峰并分别呈现正向峰或倒置峰。,（五